研究背景细胞焦亡(Pyroptosis)又称细胞炎性坏死,是一种程序性细胞死亡。相比于细胞凋亡(Apoptosis),细胞焦亡发生的更快,并伴随大量促炎症因子的释放。细胞焦亡广泛参与疾病的发生和发展,其抑制剂的开发也越来越受到研究人员的关注。细胞焦亡的激活包括Caspase-1依赖的经典途径和Caspase-4/-5/-11依赖的非经典途径。在经典途径中,活化的Caspase-1切割消皮素D(GasderminD,GSDMD),产生的GSDMD-N与细胞膜上的磷脂蛋白结合,形成跨膜孔洞。同时,活化的Caspase-1切割白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的前体 pro-IL-1β 和 pro-IL-18,形成有活性的 IL-1β和IL-18,释放到胞外,募集炎症细胞聚集,从而扩大炎症反应。Caspase-1抑制剂,如VX-765,已被证明具有体内外抗焦亡活性,可缓解多种焦亡相关疾病。因此,以Caspase-1为靶点是筛选细胞焦亡抑制剂的方向。天然小分子化合物在药物开发中具有免疫反应低、药代动力学好等优点,具有不可替代的价值。许多已获批准和临床试验的药物都是从天然产物中提取的,如青蒿素和姜黄素。目前,Caspase-1抑制剂主要是人工合成的拟肽类化合物和肽基类化合物,从天然产物中获得的Caspase-1抑制剂报道较少。因此,基于天然产物的具有体内外抗焦亡活性的Caspase-1小分子抑制剂有待被充分研究和报道。研究目的以Caspase-1为靶点,在天然产物中进行抑制剂的筛选,并在细胞模型和动物模型上进行抗焦亡活性研究,从而发现具有体内外抗焦亡活性的天然产物。研究方法1.蛋白表达和纯化通过大肠杆菌蛋白表达系统进行Caspase-1等重组蛋白的表达,通过镍柱亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析技术进行重组蛋白的纯化。2.基于2526个天然产物的Caspase-1抑制剂的筛选和验证基于重组 Caspase-1 蛋白和底物 Ac-YVAD-pNA 建立“Caspase-1+Ac-YVAD-pNA+化合物”高通量筛选体系,基于重组Caspase-1和GSDMD蛋白建立“Caspase-1+GSDMD+化合物”验证体系,对化合物的抗焦亡活性进行Pathologic complete remission初步验证。3.蛋白-小分子的分子互作实验通过表面等离子共振(Surface plasmon resonance,SPR)、差示扫描荧光(Differential Scanning Fluorimetry,DSF)和细胞热位移(Cellular thermal shift assay,CETSA)实验对化合物与Caspase-1蛋白的亲和力进行分析。通过高效液相色谱-飞行时间质谱法(High performance liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry,HPLC-Q-TOF-MS)检测 Caspase-1.蛋白的分子量。4.去甲泽拉木醛和银杏酸C15:1的细胞活性评价通过LPS和三磷酸腺苷(Adenosinetriphosphate,ATP)在BMDM细胞上建立细胞焦亡模型。通过WB检测Caspase-1和GSDMD的活化,通过ELISA检测炎症因子的释放,通过碘化丙锭(Propidiumiodide,PI)染色检测细胞死亡率,通过细胞免疫荧光检测凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis associated speck like protein containing a CARD,ASC)斑点的形成。在BMDM细胞中,通过siRNA沉默Caspase-1。分别在转染Negative siRNA和Caspase-1 siRNA的细胞上建立焦亡模型,进行去甲泽拉木醛和银杏酸C15:1活性的考察。5.去甲泽拉木醛和银杏酸C15:1的体内活性评价以LPS(5 mg/kg)气管滴注建立C57BL/6J小鼠ALI模型。在去甲泽拉木醛的动物实验中,小鼠随机分组,每组12只,组别如下:对照组、模型组、去甲泽拉木醛低剂量组(3.75mg/kg)、去甲泽拉木醛中剂量组(7.5 mg/kg)、去甲泽拉木醛高剂量组(15mg/kg)、VX-765组(50mg/kg)、地塞米松组(5mg/kg)。用0.5%CMCNa配制去甲泽拉木醛,灌胃给药。用20%Cremophor EL溶液配制VX-765,腹腔注射给药。用生理盐水稀释地塞米松注射液,腹腔注射给药。在造模前,连续给药7天,每天一次。在银杏酸C15:1的动物实验中,小鼠随机分组,每组12只,组别如下:对照组、模型组、银杏酸C15:1低剂量组(10mg/kg)、银杏酸C15:1中剂量组(20 mg/kg)、银杏酸 C15:1 高剂量组(30mg/kg)、VX-765 组(50mg/kg)、地塞米松组(5mg/kg)。银杏酸 C15:1 依次用 DMSO(10%)、PEG300(40%)、Tween-80(5%)、生理盐水(45%)溶解,腹腔注射给药。通过肺组织HE染色以及肺泡灌洗液中总蛋白、白蛋白和LDH的水平,评价去甲泽拉木醛和银杏酸C15:1对小鼠肺损伤的改善作用。通过WB、ELISA和免疫组化检测Caspase-1的活化、GSDMD的切割和炎症因子的释放,证明去甲泽拉木醛和银杏酸C15:1的体内抗焦亡活性。研究结果1.蛋白表达和纯化通过大肠杆菌蛋白表达系统获得了高纯度的炎性Caspase(Caspase-1、Caspase-4 和 Caspase-5)、非炎性 Caspase(Caspase-3 和 Caspase-6)和 GSDMD。蛋白活性检测结果显示,所纯化的几种重组蛋白的活性均较好,可用于后期化合物的筛选和活性验证实验。2.基于2526个天然产物的Caspase-1抑制剂的筛选和验证基于“Caspase-1+Ac-YVAD-pNA+化合物”高通量筛选体系对2526个天然产物进行初筛和复测,得到24个活性化合物。通过“Caspase-1+GSDMD+化合物”验证体系,对24个化合物的活性进行再验证,得到7个能够抑制GSDMD切割的目标化合物。接下来,通过分子互作技术对目标化合物与蛋白的亲和力进行检测,结果如下:①SPR结果显示腺苷钴胺与Caspase-1的KD值大于200 μM,棉酚的KD值大于50 μM,表明它们与Caspase-1的亲和力均较弱。②SPR结果显示银杏酸C15:1与Caspasae-1的KD值为4.83μM,阳性对照VX-765的KD值为11.3μM,表明银杏酸C15:1 比 VX-765对Caspase-1具有更高的亲和力。③通过DSF和CETSA考察去甲泽拉木醛对蛋白热稳定的影响。DSF结果显示,与去甲泽拉木醛孵育后,Caspase-1的Tm值从44℃增加到53.3℃。同时,基于细胞裂解液的CETSA结果也显示去甲泽拉木醛增加了 Caspase-1的热稳定性。在SPR实验中,去甲泽拉木醛在芯片上未能洗脱下来,猜测其可能与Caspase-1共价结合。因此,通过HPLC-Q-TOF-MS进行蛋白分子量的测定,结果显示与去甲泽拉木醛共孵育后,蛋白分子量增加,由此证明了去甲泽拉木醛是Caspase-1的共价抑制剂。结合动力学参数检测结果显示去甲泽拉木醛对Caspase-1的Kinact/Ki为1370.86± 74.08 M-1min-1。银杏酸C15:1类似物的结果显示漆树酸的IC50值为4.959±0.419μM,其活性与银杏酸C15:1相当,而腰果酚和水杨酸的IC50均大于200μM,考马斯亮蓝染色的胶图与酶活结果一致。由此说明银杏酸C15:1的活性需要苯环上的羧基和碳链同时存在。去甲泽拉木醛类似物的结果显示,雷公藤红素的IC50值为18.02±1.48 μM,扁蒴藤素的IC50值为168.1±23.6 μM,它们的活性均差于去甲泽拉木醛(IC50=7.255±0.371μM)。GSDMD的考马斯亮蓝染色胶图显示出相GSK1349572浓度同的结果,由此说明羧基是去甲泽拉木醛和雷公藤红素抑制Caspase-1活性的关键官能团之一。苯环上的醛基具有较强的亲电能力,能够与半胱氨酸上的巯基反应,这是去甲泽拉木醛与Caspase-1共价结合的活性官能团。另外,银杏酸C15:1和去甲泽拉木醛对Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-3和Caspase-6的酶活结果表明它们均是Caspase的广谱抑制剂。3.去甲泽拉木醛和银杏酸C15:1的细胞活性评价细胞上清的WB结果显示,正常组细胞上清中几乎无Caspase-1 p20,在LPS和ATP的刺激下,模型组细胞中大量的Caspase-1活化,形成Caspase-1 p20,释放到培养基。而去甲泽拉木醛和银杏酸C15:1分别处理后,细胞上清中Caspase-1p20水平显著降低。采用FAM-FLICACaspase-1检测试剂盒进行荧光拍照,结果显示去甲泽拉木醛和银杏酸C15:1均能降低细胞的荧光水平。由此说明,去甲泽拉木醛和银杏酸C15:1抑制了 Caspase-1的活化。细胞裂解液的WB结果显示,正常组细胞中几乎无GSDMD-N,在LPS和ATP的刺激下,模型组GSDMD被显著活化,产生大量的GSDMD-N。去甲泽拉木醛和银杏酸C15:1分别处理后,GSDMD-N的水平降低。同时,去甲泽拉木醛和银杏酸C15:1也显著降低了 IL-1β、IL-18和LDH。并且PI染色表明去甲泽拉木醛和银杏酸C15:1抑制了细胞死亡率。细胞免疫荧光结果显示去甲泽拉木醛和银杏酸C15:1均对Caspase-1上游蛋白ASC斑点的形成无明显影响。在BMDM细胞中,通过siRNA沉默Caspase-1,结果显示,与转染Negative siRNA的细胞相比,转染Caspase-1 siRNA后,Caspase-1的表达显著降低。在转染了 Negative siRNA的细胞中,2.5 μM去甲泽拉木醛和5 μM银杏酸C15:1均显著抑制了 GSDMD-N的产生,同时抑制了 IL-1β、IL-18和LDH的释放。而在转染了 Caspase-1 siRNA 的细胞中,2.5 μM 去甲泽拉木醛对 GSDMD-N、IL-1β、IL-18和LDH均无抑制作用,5μM银杏酸C15:1对GSDMD-N、IL-1β和IL-18有抑制趋势,但差异无统计学意义。4.去甲泽拉木醛和银杏酸C15:1的体内活性评价HE染色结果显示模型组小鼠的肺组织呈现严重的肺泡间质性水肿、肺泡壁增厚、中性粒细胞浸润的病理形态,同时,相对于正常组,模型组小鼠肺泡灌洗液中的总蛋白、白蛋白和LDH均显著升高。由此说明,本实验成功构建了 ALI模型。去甲泽拉木醛低、中和高三个剂量均改善了小鼠的肺组织病变,同时逆转了肺损伤所致总蛋白、白蛋白和LDH的异常升高,呈现剂量依赖性,并且高剂量的去甲泽拉木醛对肺损伤的改善作用与VX-765和地塞米松均具有统计学差异。同样,银杏酸C15:1低、中和高三个剂量也改善了小鼠的肺组织病变以及总蛋白、白蛋白和LDH的异常升高,呈现剂量依赖性,并且银杏酸C15:1的活性与VX-765和地塞米松均具有统计学差异。WB结果显示,正常组小鼠的肺泡灌洗液几乎检测不到Caspase-1 p45和Caspase-1 p20,而 ALI 模型组的 Caspase-1 p45 和 Caspase-1 p20 蛋白水平急剧增加。与肺泡灌洗液的结果相一致,肺组织的WB和免疫组化结果也显示模型组小鼠高表达的Caspase-1 p45和Caspase-1 p20,表明所建立的ALI模型具有明显的Caspase-1活化的特征,适用于评价Caspase-1抑制剂的活性。相对于模型组,去甲泽拉木醛、银杏酸C15:1和VX-765给药组小鼠的肺泡灌洗液和肺组织中Caspase-1 p45和Caspase-1 p20均显著降低。并且15 mg/kg去甲泽拉木醛和30 mg/kg银杏酸C15:1对Caspase-1的抑制作用均与阳性对照VX-765(50 mg/kg)具有统计学差异。与Caspase-1的结果一致,正常组小鼠的肺泡灌洗液中几乎检测不到GSDMD-N,模型组中检测到急剧增加的GSDMD-N,说明ALI模型中存在明显的细胞焦亡的特征。相对于模型组,去甲泽拉木醛、银杏酸C15:1和VX-765 给药组的肺泡灌洗液中仅检测到较低水平的 GSDMD-N。通过ELISA对肺泡灌洗液中的IL-1β和IL-18进行定量检测。selleckchem JNJ-42756493结果显示,正常组只检测到微量的炎症因子,模型组小鼠在LPS的诱导下,IL-1β和IL-18均显著增加(P<0.001)。去甲泽拉木醛、银杏酸C15:1、VX-765和地塞米松给药组均逆转了 IL-1β和IL-18的异常升高,其中15 mg/kg去甲泽拉木醛和30 mg/kg银杏酸C15:1的活性均与VX-765和地塞米松具有统计学差异。研究结论通过本课题的研究可以得到以下结论:1.银杏酸C15:1和去甲泽拉木醛均是Caspase-1的抑制剂,其中去甲泽拉木醛是共价抑制剂。2.在原代巨噬细胞焦亡模型中,银杏酸C15:1和去甲泽拉木醛通过抑制Caspase-1的活化发挥抗焦亡作用。3.在LPS所致小鼠ALI模型中,银杏酸C15:1和去甲泽拉木醛均显著改善肺组织病变,抑制了细胞焦亡。