新型冠状病毒感染疫情自2019年暴发以来,给全人类的健康和经济发展带来了极大的损失。新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome CoronavPR-171半抑制浓度irus2,SARS-CoV-2,简称新冠病毒)可以通过飞沫、气溶胶等途径在人与人之间快速传播。感染者表现为发烧、咳嗽等症状,严重者可能会引发肺炎。在疫情发生的早期阶段,人们曾经受到既无特效药又无预防疫苗的困扰。各国一方面利用戴口罩、保持社交距离、隔离感染者作为阻止病毒传播的主要手段,另一方optical fiber biosensor面投入大量人力物力,以最快的速度研发抗病毒药物及疫苗。新冠病毒属于正义单链RNA病毒,其基因组复制和转录由RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)执行。由于靶向RdRp的小分子抑制剂能够阻断病毒的复制和转录,且人体内不存在RdRp同源蛋白,因此RdRp成为最有吸引力的抗病毒药物靶点之一。迄今为止已有多种以RdRp为靶点的药物获准上市,包括瑞德西韦(remdesivir)、莫努匹拉韦(molnupiravir)、阿兹夫定(azvudine)等,这些药物均属于核苷类似物,对于感染者的治疗具有一定效果。然而该类药物在临床应用中也存在较多问题,主要是引起不良反应和副作用,包括尿酸升高和溶血性贫血等,并且存在致突变致畸风险。因此开发更有效,副作用更小的抗病毒药物仍然具有重要意义。目前对RdRp催化功能的研究还不够深入,对RdRp的性质表征无疑有助于开发更好的药物。相对于抗病毒药物,新冠病毒疫苗的研发进展更为迅速,从2021年开始有多种新冠疫苗上市。但是目前的疫苗还存在一些缺点和不足,如核酸疫苗会引起不良反应,灭活疫苗生产条件要求较高并且存在病毒灭活不彻底的风险,蛋白质亚单位疫苗免疫原性较弱等。因此迫切需要开发一种副作用更小、免疫效果更强的疫苗。为了有助于开发更好的抗病毒药物和疫苗,我们对包括RdRp在内的新冠病毒的多个关键蛋白质做了深入细致的性质表征。这些研究结果启发了新型核苷类药物的设计策略以及全新的疫苗开发技术。本论文的主要研究内容和研究结果如下:1.新冠病毒RdRp可以利用核苷二磷酸(nucleoside diphosphates,NDPs)作底物并可以将莫努匹拉韦二磷酸(molnupiravir diphosphate,MDP)掺入RNA产物链(1)RdRp利用NDPs作底物,且具有模板特异性和保真性采用常规的RNA延伸率测定方法测定SARS-CoV-2 RdRp聚合酶活性,结果显示,无论以核苷三磷酸(nucleoside triphosphates,NTPs)或NDPs作底物,RdRp都能合成相同长度的RNA产物。说明RdRp可以利用NDPs作底物。同时检测了利用NDPs作底物时的模板特异性和保真性。当RNA模板的第一个碱基为U时,只有理应与之配对的ADP促进了 RNA的延伸,表明NDPs的掺入具有模板特异性。本论文采用两个实验验证保真性:Sanger测序法和PCR产物的高通量测序法,两个方法表明无论以NDPs或NTPs作为底物,均得到相同的保真性结果。(2)作为RdRp的底物,NDPs的掺入效率约是NTPs的三分之二动力学曲线表明,NDPs的相对掺入效率约为NTPs的三分之二(67.94%±2.66%),然而,用NDP替代任何单个NTP对RNA合成效率没有影响。这意味着RNA的合成速率只受NDPs连续掺入的影响,而不受间歇插入的影响。(3)SARS-CoV-2 RdRp 以 MDP 作底物,合成 RNA莫努匹拉韦是针对RdRp的靶向药物,一般认为在体内以三磷酸的活性形式(MTP)发挥作用。我们发现当CTP或UTP被MDP取代时,与使用MTP作为底物时类似,同样可以合成RNA。以高通量测序的方法检测突变率,发现当体系中添加相同浓度的MTP和MDP时,表现为相似的突变率。这说明在宿主体内,莫努匹拉韦在磷酸化为二磷酸形式时已经开始作为底物掺入RNA链中,并且与三磷酸形式底物具有同等掺入效率,并引发相同的突变率。(4)不同病毒RNA聚合酶底物特异性比较SARS-CoV RdRp可以使用NDPs、MTP和MDP作底物;寨卡病毒的NS5不可以利用NDPs作底物,当用MTP或MDP替代UTP时,寨卡病毒的NS5只能弱合成RNA;而T7 RNA聚合酶可以以较低的效率利用ADP作底物转录,而不能使用其他的NDPs、MTP和MDP作底物。2.靶向RdRp药物苏拉明和Evans blue的发现确认细节与探究前期的实验发现SARS-CoV-2 RdRp具有外切核酸酶活力,并且通过设计不完全配对(即有突变)的RNA模板,检测到RdRp可以自我校对,在另外添加nsp 14-ExoN 时,校正率增加。在这个发现的基础上设计了一个筛选RdRp抑制剂的方法,其效率比传统的凝胶电泳法更高。最终,筛选到抑制RdRp活性的Evans blue和苏拉明。尽管后来的实验表明RdRp的核酸酶活力很可能是杂蛋白污染造成的假象。但是,由此方法筛选到的Evans blue和苏拉明确实可以对RdRp的聚合酶活力起抑制作用。3.新冠病毒热减毒活疫苗的构想以及初步研究由于现有新冠病毒的疫苗存在各种各样的缺点,我们构想了一种减毒活疫苗:通过降低新冠病毒关键蛋白质的热稳定性,使病毒只能在温度较低的鼻腔和上呼吸道存活,而无法在37℃的体内环境存活,则可以获得一种全新的减毒疫苗,具有预防新冠的应用可能。这个技术能够实现的关键是精确地控制病毒关键蛋白质的热稳定性。通过对新冠病毒已有蛋白质结构nsp7、nsp8、nsp14、N蛋白、3CLpro、PLpro蛋白进行分析,选择结构核中的色氨酸、甲硫氨酸等氨基酸进行突变,突变蛋白质的立体结构变得松散,其热稳定性发生变化。利用3CLpro蛋白酶检测了蛋白变性温度与酶活力之间的关系,发现当突变体蛋白Tm值在41-43℃时,蛋白酶33℃孵育后丧失了 50%左右的酶活力,37℃孵育后丧失了约90%的酶活力。利用蛋白质变性温度降低的突变体或其组合,可以挑选出在鼻腔或上呼吸道存活而不能在体内存活的突变体,以达到构建减毒活疫苗的目的。综上所述,本论文首先对RdRp聚合酶活性进行表征,发现其可以利用NDPs作底物,并可以以莫努匹拉韦二磷酸作底物合成新的RNA,随后与其他病毒的RdRp进行了比较研究。此外,筛选到靶向RdRp的抑制剂Evans blue和苏拉明。最后,通过对几种新冠病毒关键蛋白质进行氨基酸突变和活力检测,提出一种构建新型减毒活疫苗的设想。关于RdRp功能的新发现不仅可以拓宽我们对SARS-CoV-2的了解,还可以为抗病毒药物设计提供新的策略。热减毒疫苗的构想也可以为预防新冠病毒以及其他呼吸道病毒提供新思路。