Emery-Dreifuss肌营AMG510浓度养不良症(Emery-Dreifuss muscular dystrophy,EDMD)是一种遗传性神经肌肉疾病,表现为早发性关节挛缩、心脏受累和进行性肌无力的三联征。最新的研究表明,SUN1/SUN2基因突变与其他EDMD致病基因突变相结合可以加重病人的临床症状。目前关于SUN结构域蛋白功能的研究,主要集中在人和小鼠,而斑马鱼作为一种研究胚胎发育的理想模型,其Sun结构域蛋白的功能还鲜有报道。为了进一步探究SUN蛋白在神经肌肉发育中的功能,我们以斑马鱼为模式动物,应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建并筛选sun1、sun2单基因敲除以及双基因纯合敲除突变体(sun1~(-/-)、sun2~(-/-)和sun1~(-/-)sun2~(-/-)突变体)。本课题以筛选获得的斑马鱼Sun蛋白敲除突变体为实验材料,深入研究Sun蛋白的缺失对斑马鱼神经肌肉发育的影响,主要包括以下内容:1.通过生物信息学技术对斑马鱼Sun1和Sun2蛋白的序列保守性进行了分析,结果显示,人、鼠和斑马鱼SUN/Sun蛋白的C末端都存在保守的SUN结构域。为了探究斑马鱼Sun蛋白的亚细胞定位,我们构建了pCS2-sun1-EGFP和pCS2-sun2-EGFP真核过表达载体,分别转染NIH3T3细胞,免Oncology Care Model疫荧光实验结果表明:过表达的斑马鱼Sun1和Sun2蛋白均定位于细胞核膜上,这与哺乳动物SUN1和SUN2蛋白的亚细胞定位相一致。2.为了探究sun1、sun2基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的时空表达,本研究利用qRT-PCR与全胚原位杂交技术初步建立了Sun蛋白的时空表达谱,即sun1、sun2基因的mRNA表达量随着胚胎早期发育时期的延长呈逐渐上升;在幼鱼的不同部位呈普遍表达,且在头部、肌肉等部位高表达;成鱼不同组织中mRNA表达量的检测结果显示,sun1、sun2基因在各个组织中均有表达,且sun2在精巢中表达量最高。3.为了阐明sun1、sun2的缺失购买NSC 127716对神经肌肉发育的影响,我们使用qRT-PCR和全胚原位杂交技术检测了神经肌肉发育相关基因的表达,结果显示:24hpf和5dpf时,sun1、sun2单纯合及双纯合缺失均能够引起斑马鱼胚胎神经肌肉相关基因的异常表达,提示突变体的神经系统和骨骼肌可能受损。为了进一步明确sun1、sun2的缺失对骨骼肌发育的影响,我们利用罗丹明标记的鬼笔环肽染色观察斑马鱼突变体的肌纤维形态和结构特点,结果显示,与野生型AB相比,基因敲除突变体的纤维状肌动蛋白排列整齐,间隙分明,两者无明显差异。为了进一步探究sun1、sun2的缺失对心脏发育的影响,我们通过对AB野生型、sun1~(-/-)、sun2~(-/-)及sun1~(-/-)sun2~(-/-)突变体胚胎的心率及心脏标记基因cmlc2的表达进行了检测,结果显示,与野生型AB相比,基因敲除突变体组胚胎心率明显加快,但cmlc2的空间表达无明显差异。4.将野生型AB和基因敲除突变体组(sun1~(-/-)、sun2~(-/-)及sun1~(-/-)sun2~(-/-)突变体)进行转录组测序,差异基因功能富集结果表明sun1和sun2基因可能参与神经调节、肌肉发育、激素等合成和代谢相关的过程。综上所述,本研究首先克隆了斑马鱼sun1和sun2基因,并对其序列保守性及亚细胞定位进行了分析,同时绘制了斑马鱼sun1和sun2基因的时空表达谱;其次,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了斑马鱼sun1~(-/-)、sun2~(-/-)及sun1~(-/-)sun2~(-/-)突变体,并从神经、肌肉、心脏发育等方面对其表型进行了初步分析;最后,sun1~(-/-)、sun2~(-/-)及sun1~(-/-)sun2~(-/-)突变体的转录组测序分析表明,sun1和sun2基因可能参与神经调节、肌肉发育、激素等合成和代谢相关途径,这将为进一步深入探索sun1和sun2基因的功能及其导致Emery-Dreifuss肌营养不良症的分子机制打下基础。