中国是世界蚕桑大国,每年蚕茧产量70万吨左右,而蚕病会导致蚕茧产量下降、品质劣化等问题。细菌性肠道病是家蚕主要病害之一,目前应对家蚕细菌性肠道病的主要防治措施是添食抗生素。然而,抗生素的过度使用会导致细菌产生耐药性并且造成环境污染。抗菌肽是一种具有广谱抑菌效果、不易产生耐药性且无毒副作用的新型抗菌剂。因此,本文以抗菌肽SAAP-148为研究对象,探究外源抗菌肽对家蚕致病菌的抑制作用,为外源抗菌肽在家蚕细菌病防治中的应用提供参考。本文通过细菌性肠道病发病时家蚕中肠组织中内源抗菌肽的表达变化,分析抗菌肽对家蚕细菌性肠道病的免疫反应。在此基础上,从自然感染细菌性肠道病的家蚕中肠组织中分离出致病菌,并体外检测抗菌肽SAAP-148对分离出的致病菌及常见家蚕细菌病的病原菌的抑制作用。最后使用酵母表达系统表达抗菌肽SAAP-148,为抗菌肽SAAP-148大规模开发应用提供技术储备。主要研究结果如下:一、内源抗菌肽在家蚕感染细菌性肠道病后显著上调5龄3天健康家蚕卵巢、精巢、气管、血淋巴、中肠、丝腺、马氏管和脂肪体中有多种内源抗菌肽基因表达,且呈现相对平稳表达现象。大部分内源抗菌肽相对Bm GADPH表达量为0.001～0.1,只有少数抗菌肽基因在精巢、马氏管和中肠中表达量相对较高,相对表达量为0.3以上,这可能与不同抗菌肽基因在家蚕体内参与不同生命活动有关。自然感染细菌性肠道病的家蚕5龄第4天家蚕中肠组织中抗菌肽表达量较同期饲养的健康家蚕显著上调,表明家蚕内源抗菌肽在家蚕感染细菌性肠道病后,抗菌肽在抵抗细菌感染过程中发挥了一定免疫调控作用。二、感染细菌性肠道病的家蚕中肠中分离的8种细菌在一定程度上均具有致selleckchem PD0325901病性感染细菌性肠道病的家蚕中肠组织中分离所得8种细菌为松鼠葡萄球菌Mammaliicoccus sciuri、霍氏肠杆菌Enterobacter hormaechei、布甘氏肠杆菌Enterobacter bugandensis、弗劳地枸橼酸杆菌Citrobacter freundii、克雷伯氏肺炎杆菌Klebsiella pneumoniae、变栖克雷伯菌Klebsiella variicola、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila和生癌肠杆菌Enterobacter cancerogen。添食和穿刺实验结果显示8种细菌在一定程度上均具有致病性,其中松鼠葡萄球Farmed sea bass菌、嗜水气单胞菌、生癌肠杆菌和布甘氏肠杆菌致病性较强,霍氏肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌和变栖克雷伯菌致病性稍弱,但都可引起家蚕发育迟缓、畸形以及腹泻直至死亡等细菌性肠道病症状。三、SAAP-148对细菌性肠道病菌有抑制效果以抗生素氨苄作为对照进行抑菌实验。实验结果显示合成抗菌肽SAAP-148对发生细菌性肠道病的家蚕中肠中分离出的8种致病菌以及大肠球菌Escherichia coli、黑胸败血芽孢杆菌Bacillus bombyseptieus、苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis和灵杆菌Serratia marcescens均具有一定体外抑制效果,抑菌效果随抗菌肽SAAP-148浓度增大而增强,且抗菌肽SAAP-148对对抗生素氨苄已产生抗性的霍氏肠杆菌和弗劳地枸橼酸杆菌依然具有抑制效果。四、构建抗菌肽SAAP-148酵母表达系统并优化表达条件对抗菌肽SAAP-148、融合表达蛋白HSA和SUMO进行密码子改造后,构建酵母表达质粒p PIC9k-HSA-SAAP-148与p PIC9k-SUMO-SAAP-148,将质粒电转入酵母细胞GS115后,Western Blot检测到抗菌肽SAAP-148融合蛋白的表达。在对表达条件优化后,质粒PKHS在摇瓶水平最适表达条件为培养基BMGY与BMMY的比值为3:1,装液量10%,添加生物素且甲醇添加量为0.8%,培养基初始PH 7,32℃,220 rpm,蛋白表达量优化后由1.8 mg/m L提升至2.7 mg/m L,提高至1Pevonedistat分子量.5倍。综上,家蚕内源抗菌肽在家蚕感染细菌性肠道病后表达量显著上调,说明家蚕内源抗菌肽在家蚕细菌病肠道病的发病过程中具有一定的免疫反应,但并不能有效阻止细菌性肠道病的发生。人源抗菌肽SAAP-148具有广谱抗菌作用,对引起家蚕细菌病的多种致病菌均具有一定的抑制作用,具有代替抗生素用于家蚕细菌病防治的潜力。酵母表达系统成功表达抗菌肽SAAP-148的融合蛋白为酵母表达系统直接表达抗菌肽SAAP-148、提高抗菌肽SAAP-148的产量奠定了基础。