由密执安棒状杆菌密执安亚种Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis(Cmm)引起的番茄细菌性溃疡病,是番茄的破坏性疾病之一,对全球番茄生产构成严重威胁。该病原菌传播快,致病性强,严重影响了番茄的产量和品质。虽然化学防治可以用于预防和治疗番茄溃疡病,但过度依赖会导致病原菌产生抗药性、环境污染和食品安全等问题。因而在农业生产中迫切需要一种新型的抗菌制剂来防治番茄细菌性溃疡病菌。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)因其具有良好的抗菌效果、不易产生抗药性和对环境友好性而备受关注,被认为是一种理想的抗菌剂。鉴于此,本研究以抗菌肽Jelleine-Ⅰ和设计的抗菌肽P235为研究对象,首先测定了它们对Cmm的抗菌活性,继而对它们的细胞膜和细胞内靶点作用机制进行研究,通过烟草叶片评价抗菌肽对Cmm的抗菌效果。主要研究结果如下:(1)Jelleine-Ⅰ、P235和农用链霉素对Cmm的MIC分别为25μg/m L、12.5μg/m L和1000μg/m L。Jelleine-Ⅰ对Cmm的EC_(50)和IC_(50)分别为4.62μg/m L和4.98μg/m L,P235对Cmm的EC_(50)和IC_(50)分别为2.47μg/m L和2.36μg/m L,农用链霉素对Cmm的EC_(50)和IC_(50)分别为214.83μg/m L和210.96μg/m L,表明两种抗菌肽的抗菌活性优于商品化的农用链霉素,且设计的抗菌肽P235的抗菌活性优于Jelleine-Ⅰ。动态抑菌结果表明Jelleine-Ⅰ和P235在2 MIC和1 MIC的浓度下均可以显著抑制Cmm的生长。协同作用结果表明,较低浓度(1/4 MIC-1/256 MIC)的Jelleine-Ⅰ、P235可以与EDTA(1/4 MIC-1/8 MIC)产生协同效应;(2)细胞膜通透性结果表明抗菌肽Jelleine-Ⅰ、P235处理Cmm均可以造成细胞膜通透性增加。1 MIC的Jelleine-Ⅰ和P235处理4 h后的Cmm细胞膜通透率从4.60%分别增加到9.37%和11.78%。钙离子泄露实验发现,1 MIC的Jelleine-Ⅰ、P235处理8 h后,细胞外钙离子的浓度分别增加到0.096 m M和0.117 m M。PI染色结果显示,Cmm经1 MIC的P235处理1 h和2 h后,细胞膜的通透率分别为2.29%和8.93%。细胞膜去极化检测结果表明,2种抗菌肽作用于细胞膜,均可引起膜去极化;(3)扫描电镜结果显示,1 MIC的Jelleine-Ⅰ和P235处理4 h后的Cmm细胞表面凹陷、畸形、细胞膜破损。透射电镜结果显示,Jelleine-Ⅰ和P235处理后,Cmm细胞膜受损,边缘模糊、胞内物质泄露,说明抗菌肽可以对Cmm细胞膜造成损伤,导致细胞死亡;(4)FITC-P235和DAPI共染色结果显示,P235与DAPI在Cmm细胞内共定位,表明抗菌肽可与Cmm的DNA作用。DNA和RNA凝胶阻滞电泳结果显示,Jelleine-Ⅰ和P235均能与Cmm基因组DNA和RNA结合,并且以浓度依赖性的方式延缓DNA和RNA的迁移。R更多T-q PCR结果表明,与对照组相比较,1 MIC的Jelleine-Ⅰ、P235处理Cmm 12 h后,DNA复制相关基因(dna A)的表达显著上调,DNA修复相关基因(rec A)的表达则下调;(5)ROS测定结果显示,抗菌肽Jelleine-Ⅰ、P235以剂量依赖的方式诱导Cmm细胞内ROS累积。加入ROimmune risk scoreS清除剂后,Jelleine-Ⅰ和P235的MIC增加,活性降低。非特异性酯酶活性测定结果显示,与对照组相比,2 MIC和1 MIC的Jelleine-Ⅰ和P235处理后,Cmm细胞内荧光强度显著降低,表明抗菌肽可以影响细胞内非特异性酯酶的活性;(6)Cmm对烟草叶片的HR反应结果表明,https://www.selleck.cn/products/Lapatinib-Ditosylate.html与未处理组相比,1 MIC的Jelleine-Ⅰ和P235处理后,叶片损害程度明显减轻,说明抗菌肽Jelleine-Ⅰ和P235可以减少Cmm对烟草叶片的毒力。本研究在理论上有助于抗菌肽对Cmm作用机制的认知,在应用上可为抗菌肽开发成新型杀菌剂提供理论基础。