褐藻胶是褐藻中含量最丰富的多糖,可达到藻类生物质干重的40%,由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)两种单体通过1,4糖苷键连接组成。褐藻胶裂解酶属于多糖裂解酶(polysaccharide lyase,PL),主要参与褐藻胶的降解,在海洋碳循环中发挥重要作用。褐藻胶裂解酶主要来源于海洋细菌,弧菌是一种常见的水生细菌,也是常见的褐藻胶降解类群,已从中发现多种新型褐藻胶裂解酶。褐藻寡糖(alginate oligosaccharide,AOS)是褐藻胶的降解产物,具有降血糖、降血脂、免疫调节等多种生理活性,在农业、食品、医药等领域有广阔的应用前景。因此,从弧菌中挖掘新型或有应用潜力的褐藻胶裂解酶,对它们进行研究,实现AOS的大量制备,不仅有利于增加对弧菌褐藻胶降解过程的理解,也为褐藻胶裂解酶的应用开发奠定基础。本论文首先从实验室已进行全基因测序的弧菌中发现了 PL7家族双催化结构域褐藻胶裂解酶基因alyC6′,通过蛋白异源表达、纯化及检测重组酶的酶学性质,揭示了双催化结构域之间的协同作用,并对具有多个催化结构域的褐藻胶裂解酶的广泛性进行了分析。然后,对另一株实验室已测序的弧菌中11个Dibutyryl-cAMP使用方法褐藻胶裂解酶进行了异源表达和纯化,分析了重组酶的酶学性质,从中筛选出比活力较高、产物主要为三糖的双功能褐藻胶裂解酶AlyC7。构建了重组大肠杆菌实现了 AlyC7的分泌表达,并对培养基添加物和培养条件进行了优化。最后,利用胞外分泌Regorafenib IC50的重组褐藻胶裂解酶制备了 AOS,分析了AOS的组成及纯度,并研究了 AOS对植物根生长的促进作用。1.Vibrio sp.NC2新型褐藻胶裂解酶双催化结构域的协同作用研究从Vibrio sp.NC2中挖掘到具有双催化结构域的PL7家族褐藻胶裂解酶AlyC6′,对其原酶和两个催化结构域分别进行异源表达和纯化。结果表明,AlyC6’的两个催化结构域都能够单独降解褐藻胶,且与AlyC6’的最适酶活条件一致,最适温度均为30℃,最适pH为8.0,在0.5 M NaCl条件下酶活最高。AlyC6′-CD1对PM底物活性最高,对PG几乎无活性;AlyC6′-CD2对PG活性最高,对PM几乎无dual infections活性,而AlyC6’对PM活性最高同时对PG有一定的活性。AlyC6’和AlyC6′-CD1的最小底物为三糖,而AlyC6′-CD2的最小底物为四糖。从动力学参数来看,AlyC6′-CD1对底物的降解效率更高,AlyC6′-CD2的底物亲和力更高。AlyC6′-CD1能迅速降解AlyC6′-CD2产生的寡糖产物,且摩尔浓度相同时AlyC6’的比活力要高于AlyC6′-CD1与AlyC6′-CD2混合酶的比活力。以上结果表明AlyC6’两个结构域有显著的协同作用。生物信息学分析表明多催化结构域褐藻胶裂解酶在黄杆菌目和交替单胞菌目广泛存在。2.Vibrio sp.C42褐藻胶裂解酶的异源表达与性质研究从Vibrio sp.C42基因组中挖掘到1 1个褐藻胶裂解酶基因,对其分别进行表达纯化与酶学性质分析。除AlyC4外,共10个重组酶对褐藻胶有活性,其中AlyC1、AlyC3、AlyC6、AlyC7、AlyC9、AlyC10和AlyC11都具有对四种褐藻胶底物的降解活性,属于双功能酶。AlyC7的产物中三糖峰面积占产物峰面积的80%以上,具有大量制备三糖的潜力,且比活力是双功能酶中最高的。AlyC7的最适温度为30℃,最适pH为9.0,在0.5 M NaCl条件下酶活最高。3.褐藻胶裂解酶AlyC7在大肠杆菌中的分泌表达及表达条件优化为实现褐藻胶裂解酶AlyC7在大肠杆菌中的分泌表达,我们选择了 OmpT、OmpA、PhoA、PelB和MalE 5种信号肽以及alyC7基因自身信号肽分别构建了重组表达载体,并进行活性验证。其中携带OmpA、PelB或MalE的重组菌株可以胞外分泌褐藻胶裂解酶。向培养基中加入0.3%(w/v)蔗糖、0.3%(w/v)山梨醇、0.03%(v/v)SDS、1%(w/v)甘氨酸或1%Triton X-100后测定重组菌株胞外酶活的变化情况,发现PelB-AlyC7在添加甘氨酸后的胞外酶活最高。对PelB-AlyC7的培养基添加物和培养条件分别进行单因子优化,然后进行正交优化,最终确定的产酶发酵条件为:培养温度20℃,甘氨酸浓度500 mM,培养时间24h。在该条件下,胞外褐藻胶裂解酶酶活达到1122.8 U/mL。4.利用重组酶AlyC7制备褐藻寡糖及其促植物种子根生长的应用潜力分析以重组菌PelB-AlyC7的发酵上清液为AlyC7酶液,酶解褐藻胶制备AOS,我们对酶解条件进行了优化,分析了产物AOS的组成及纯度,并探究了 AOS对植物生长的促进作用。最适的酶解条件为:酶料比(E/S)25 U/mg,缓冲液为40mM PBS(pH 8.0),30℃反应45 min。褐藻酸钠底物的降解率为87.5%。酶解得到的AOS产物中三糖纯度为84.89%,含有少量的二糖和四糖。20 μg/mL的AOS对双子叶植物番茄和生菜种子根的生长有明显的促进作用,而对单子叶植物小麦和玉米的促进效果不明显。本论文对重要的褐藻胶降解类群——弧菌的褐藻胶裂解酶进行了挖掘、表征和应用潜力分析。首次揭示了一弧菌来源的新型双催化结构域褐藻胶裂解酶AlyC6’结构域间的协同作用。挖掘了来自Vibrio sp.C42的具有生产褐藻三糖潜力的褐藻胶裂解酶AlyC7,构建了其大肠杆菌高效分泌表达体系,并初步评价了其在促植物种子根生长方面的应用潜力。研究结果丰富了我们对褐藻胶裂解酶以及弧菌对褐藻胶降解的认识,并为褐藻胶裂解酶的开发应用奠定了基础。