弓形虫是属于顶复门原虫的专性胞内寄生虫,其宿主包括了几乎所有的温血动物。根据流行病学数据估计,全世界超过30%的人口感染了弓形虫。当机体免疫系统受损时或在先天性感染的个体中,弓形虫病可能危及生命。在畜牧业,弓形虫病也被发现是引起母畜流产和死胎的重要原因。除隐孢子虫外,大多数顶复门原虫都拥有一个独特的细offspring’s immune systems胞器-顶质体。顶质体具有寄生虫不可或缺的代谢途径,如需要丙酮酸作为底物的异戊二烯前体生物合成途径。丙酮酸是顶质体中的关键代谢分子,但是,顶质体中的丙酮酸来源仍不清晰。本实验室的研究证明,弓形虫顶质体中的丙酮酸激酶2(Pyruvate kinase2,PYK2)将磷酸烯醇式丙酮酸催化生成IACS-10759半抑制浓度丙酮酸不是顶质体内丙酮酸的主要来源,提示顶质体可能存在输入丙酮酸的途径。本研究使用弓形虫作为模型,利用生物信息学分析筛选到两个潜在的转运蛋白:APC1和APC2(Apicoplast Pyruvate Carrier),经基因编辑、靶向代谢组学、异源表达系统和超分辨显微镜等多种技术方法证明了APC为顶质体丙酮酸转运蛋白,并对其转运功能和生物学功能进行了研究。具体研究内容包括:(1)弓形虫顶质体潜在丙酮酸转运蛋白的筛选与鉴定在分析已发现的转运蛋白如MPC、BASS2和MCT等的特征后,本研究使用Toxo DB中的策略分析功能,通过设置CRISPR表型值评分(Phenotype Score≤-3)、物种特异性(不与隐孢子虫同源)和跨膜特征(TM≥3)等条件,成功筛选到7个潜在的顶质体转运蛋白。最后结合序列分析和构建原位标签定位虫株,确定了两个潜在的顶质体丙酮酸转运载体蛋白并命名为APC1和APC2。本研究聚焦APC2,对其功能进行了深入研究。为验证APC2蛋白在弓形虫生长中的作用,使用条件性蛋白降解系统构建了APC2-m AID虫株。实验结果显示,APC2条件性降解导致弓形虫的生长受到严重影响,其胞内生长受到抑制,空斑也无法形成。~(13)C葡萄糖标记的靶向糖代谢流分析显示,APC2的降解造成糖酵解和三羧酸循环发生了紊乱,~(13)C标记流入糖酵解中间代谢产物(如6-磷酸葡萄糖、果糖-6-磷酸等)和三羧酸循环中间代谢产物(如柠檬酸、顺-乌头酸、琥珀酸等)的量显著减少。这些研究表明APC2是维持虫体的正常生长所必需的,即APC2是弓形虫顶质体的关键蛋白。(2)APC2对维持顶质体的功能和完整性至关重要丙酮酸作为顶质体重要代谢途径MEP和FASⅡ的主要底物,它的产生或来源的稳定对维持顶质体的功能至关重要。对APC2-m AID虫株进行~(13)C葡萄糖标记的靶向脂代谢流和靶向MEP质谱等多种检测,结果显示,在APC2条件性降解后,FASⅡ途径的主要产物肉豆蔻酸(C14:0)和棕榈酸(C16:0)的~(13)C标记含量均大幅下降;MEP途径的主要产物IPP/DMAPP和MEP的含量也显著减少,仅为正常水平的5%-17%,这表明APC2对维持顶质体的正常代谢十分重要。随后,采用顶质体计数和q PCR对顶质体的完整性进行了检测,结果显示,在APC2条件性降解后,顶质体在蛋白和基因水平均发生了明显的缺陷。以上结果说明,APC2对维持顶质体的功能和完整性至关重要。(3)APC复合物具有转运丙酮酸的能力利用同源重组基因缺失技术,构建了缺失丙酮酸转运蛋白的大肠杆菌突变体。而后将APC1、APCVX-765 NMR2表达在大肠杆菌突变体中,并使用斑点试验和放射性同位素[2-~(14)C]丙酮酸吸收实验分别对单独表达APC1、APC2和同时表达APC1与APC2的菌株的丙酮酸转运能力进行评估。结果说明,APC1或APC2的单独表达均没有转运丙酮酸的功能;仅在APC1和APC2同时表达时具有稳定的丙酮酸转运功能;离子依赖性实验说明其转运能力受H~+和Na~+的影响。为探究上述APC1与APC2仅在共表达时具有转运丙酮酸功能的内在原因,本研究通过STED(Stimulated emission depletion)、Split-GFP和Bi FC(Bimolecularfluorescence complementation)技术对APC的跨膜拓扑结构和互作关系进行了研究。结果显示,APC1定位于顶质体膜,且其N端定位于最外侧膜,其C端处于最外侧膜和次外侧膜之间;APC2同样定位于顶质体膜,且其N和C端均定位于最外侧膜;经Bi FC技术检测,APC1和APC2在顶质体膜上有互作关系。以上结果说明,APC在顶质体膜中以复合物的形式行使转运丙酮酸的功能。综上所述,本研究发现了潜在的顶质体转运蛋白,鉴定了它们以复合物的形式构成顶质体丙酮酸转运载体,将细胞质中丙酮酸导入顶质体。APC2的生物学功能研究证明其在虫体生长和顶质体功能等方面的重要作用。本研究为理解顶质体代谢提供了重要依据,APC的独特属性也为抗寄生虫药物的设计提供了新的靶标。