黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivaleno,DON)和赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)在饲料及原料中混合污染严重,对动物和人类健康产生严重的危害。霉菌毒素通过诱导细胞氧化应激导致细胞线粒体损伤,进而产生免疫毒性。绿原酸已被证Chemical and biological properties明具有抗霉菌生长、增强机体抗氧化和免疫等功能。但是目前关于绿原酸对霉菌毒素诱导的线粒体动力学失衡和RLR损伤的研究还未见报道。本研究首先从绿原酸、异绿原酸A、新绿原酸中筛选出拮抗联合霉菌毒素效果最好的药物,然后探究该药物对联合霉菌毒素诱导的猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAM)线粒体动力学和RLR通路破坏的保护作用。为临床生产中联合霉菌毒素污染的防控以及绿原酸的应用提供理论依据。具体试验内容如下:试验一:绿原酸、异绿原酸A、新绿原酸对AFB1、DON、OTA联合暴露药物和浓度筛选本研究首先筛选拮抗联合霉菌毒素效果最好的绿原酸同分异构体。采用CCK-8法检测三种绿原酸同分异构体(2、4、8、16、32、64、128μg/m L)对PAM细胞的细胞毒性的影响。结果表明128μg/m L的三种绿原酸同分异构体明显表现出细胞毒性,浓度在64μg/m L时PAM细胞活力保持在85%以上。然后分别选取低、中、高(16μg/m L、32μg/m L、64μg/m L)的三种绿原酸同分异构体与AFB1、DON、OTA(0.94μg/m L、0.185μg/m L、1.255μg/m L)联合霉菌毒素共同处理细胞24 h,检测PAM细胞活力。结果发现与单独添加联合霉菌毒素组相比,添加64μg/m L的三种绿原酸同分异构体后PAM细胞活力最大,说明64μg/m L的三种绿原酸具有最佳的抗联合霉菌毒素效果。然后使用64μg/m L的三种绿原酸同分异构体与联合霉菌毒素共同处理PAM细胞24 h,检测细胞ROS水平和GPX4的含量,结果发现64μg/m L异绿原酸A较其他两种绿原酸极显著降低联合霉菌毒素诱导ROS水平,升高GPX4表达量(P<0.05)。所以后续试验选用64μg/m L的异绿原酸A。试验二:异绿原酸A对联合霉菌毒素致PAM细胞线粒体动力学失衡的影响试验设置对照组(C组)、联合霉菌毒素组(M组)、异绿原酸A组(ICCA组)、异绿原酸A与联合霉菌毒素共同处理组(ICCA+M组)。(1)通过流式细胞术检测PAM细胞的线粒体ROS水平。结果发现,PAM细胞经www.selleck.cn/products/cx-5461联合霉菌毒素处理24 h后,相较于C组线粒体ROS的水平显著升高(P<0.05)。与M相比,同时添加霉菌毒素和异绿原酸A组的线粒体ROS水平显著降低约40%(P<0.05)。综上,异绿原酸A能够有效缓解由联合霉菌毒素诱导线粒体ROS升高。(2)通过q PCR和WB检测线粒体动力学相关蛋白Drp1、Opa1、Fis1、Mfn1以及Mfn2的m RNA和蛋白表达情况。结果表明,与C组相比PAM细胞经联合霉菌毒素处理24 h后,细胞内线粒体融合蛋白Opa1、Mfn1和Mfn2的m RNA和蛋白表达量均降低(P<0.05或0.01);线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1的m RNA表达量升高(P<0.05或0.01)。ICCA+M组相较于M组PAM细胞融合蛋白的m RNA水平均升高(P<0.05或0.01);分裂蛋白的m RNA和蛋白表达情况极显著降低(P<0.01)。表明异绿原酸A能够有效改善由联合霉菌毒素诱导的线粒体动力学失衡。试验三:异绿原酸A致联合霉菌毒素对PAM细胞RLR通路的影响试验设分组同试验二。(1)将64μg/m L的异绿原酸A与联合霉菌毒素(0.94μg/m L AFB1、0.185μg/m L DON、1.255μg/m L OTA)共同处理PAM细胞24 h后,检测RIG-I、MAVS、IRF3、NF-κB的基因和蛋白表达情况。结果表明,联合霉菌毒素感染能够使PAM细胞RIG-I、MAVS、NF-κB的m RNA和蛋白表达显著升高(P<0.05或0.01),使IRF3的m RNA和蛋白表selleck Telaglenastat达极显著降低(P<0.01)。经异绿原酸A处理后,细胞中RIG-I、MAVS、NF-κB的基因和蛋白表达显著降低(P<0.05或0.01),IRF3的基因和蛋白表达有所恢复(P<0.01)。(2)然后我们利用q PCR法和ELISA对细胞内的RLR通路下游的细胞因子进行检测。结果发现,联合霉菌毒素感染后细胞内IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α的m RNA和蛋白表达升高(P<0.05或0.01),IFN-α蛋白水平极显著降低(P<0.01)。与M组相比,ICCA+M组显著降低了细胞内促炎细胞因子的m RNA和蛋白表达水平,升高了IFN-α的m RNA和蛋白表达量。表明异绿原酸A能够改善由联合霉菌毒素诱导的炎症反应以及调节机体免疫功能。结论:(1)64μg/m L的绿原酸、异绿原酸A、新绿原酸均能够拮抗联合霉菌毒素诱导的细胞毒性、ROS升高以及GPX4表达降低,后续试验选取64μg/m L的异绿原酸A进行。(2)霉菌毒素联合暴露能导致PAM细胞线粒体ROS水平升高,使线粒体动力学失衡。64μg/m L的异绿原酸A能够改善联合霉菌毒素诱导的线粒体损伤,减少线粒体ROS释放,平衡线粒体分裂融合蛋白的表达。(3)异绿原酸A能够有效改善由联合霉菌毒素诱导的RLR通路激活,降低RIG-I、MAVS、IRF3、NF-κB以及下游细胞因子的表达,升高IRF3及IFN-α的表达。表明异绿原酸A能够抑制霉菌毒素诱导的炎症反应,提高机体免疫功能。综上异绿原酸A有望用于临床上霉菌毒素的防控。