研究背景:在临床及科研领域,通常利用源于组织、器官或肿瘤的体外模型来研究疾病发展及转移机制、测试筛选药物、研发新型药物。然而,传统的2D模型环境与体内真实的环境差异巨大,并可能由此得到误导性的实验结果。3D模型可以更好地模拟生物体内的真实环境状态以及器官和癌症的遗传NSC125066采购生物特征,更好地用于研究细胞和器官功能、疾病发生进展机制以及评估药物药理毒理等方面。材料与方法:在利用3D生物打印构建胆管癌(CCA)免疫微环境模型、探究肿瘤相关间质细胞功能的研究中,我们首先在2D环境中培养CCA细胞系RBE、人脐静脉内皮细胞HUVEC、成纤维细胞CCC-HPF-1以及人单核白血病细胞THP-1。随后将THP-1细胞利用PMA、IL-4/IL-13激活为M2巨噬细胞,并根据文献报道将上述间质细胞激活为肿瘤相关间质细胞。考虑到在3D环境中直接混合肿瘤细胞和间质细胞会导致两种类型细胞在生长过程中发生接触抑制效应,因此我们使用3D生物打印机来分别打印含有间质细胞的水凝胶(外侧环状结构)包绕含有胆管癌细胞水凝胶(内侧网格状结构)组成的结构。随后探究肿瘤细胞在不同模型中的存活状态、细胞增殖能力、相关基因在mRNA以及蛋白水平的表达情况、抗肿瘤药物耐受情况以及其他指标。在利用声学全息术(声镊,AH)构建原代小鼠肝细胞(PMH)肝功能模型的研究中,我们首先改良原有的小鼠肝细胞灌注分离方法,结合自制的原代培养基,实现了 PMH体外的长期培养及扩增。随后我们自行设计并构建了声镊相关仪器装置,借此构建PMH声镊模型。以2D培养PMH及3D培养(3DC)模型为对照组,验证PMH声镊模型的特点。在此实验中,我们利用苏木精—伊红染色观察了声镊模型中PMH成球状态。此外,我们还对不同模型中细胞存活比例、细胞增殖状态、肝细胞相关基因表达活力、肝细胞相关功能(糖原贮存能力、吲哚菁绿(ICG)摄取/释放能力、蛋白摄取合成分泌能力等),以及细胞色素P450酶诱导表达能力等进行了比较和验证。研究结果:我们成功构建3D生物打印模型以模拟CCA肿瘤免疫微环境。各组中RBE细胞以及肿瘤相关间质细胞的活力在整个实验周期中始终保持90%以上。CCK8实验显示,与在2D环境中培养的细胞相比,3D生物打印模型中细胞增殖速率较高,且与肿瘤相关成纤维细胞(TAF)或肿瘤相关巨噬细胞(TAM)共培养的RBE 比单独培养或与肿瘤相关内皮细胞(TEC)共培养的RBE具有更高的增殖能力。qRT-PCR结果及免疫荧光(IF)实验显示,3D生物打印模型中培养的细胞在增殖、肿瘤干细胞和耐药方面相关基因的表达水平显著高于2D环境中的细胞。此外,间质细胞TAF和TAM的存在可以提高RBE的恶性程度,而TEC对RBE则没有此类Fetal Immune Cells影响。为了评估肿瘤细胞在不同模型中对抗肿瘤药物的反应,3D生物打印细胞和2DRBE用不同浓度的吉西他滨、顺铂和5-氟尿嘧啶分别进行处理。结果显示,间质细胞TAF和TAM的存在增加了 RBE对上述药物的耐药性。最后,利用qRT-PCR和IF检测了 CCA中上皮—间质转化(EMT)相关基因表达的变化。结果显示,3D生物打印环境显着促进了 RBE的迁移和侵袭,增加了 Vimentin、N-cadherin和MMP9的表达,降低了 E-cadherin的表达。3D生物打印环境中的细胞Wnt/β-catanin 通路基因(β-catenin、cyclin D1 和 c-Myc)的表达增加。表明 3D生物打印环境可能以Wnt/β-catenin信号依赖性的方式促进肿瘤细胞的间充质表型的表达。我们利用声镊装置成功构建PMH声镊培养模型。PMH在AH模型中成功进行增殖并分裂形成细胞球状结构。在整个实验周期中购买STM2457,AH模型中活细胞比例始终在96%以上,而3DC模型中活细胞比例则为86%～93%。CCK-8结果显示,2D细胞在第5天前后出现逐步凋亡,3DC和AH模型中的PMH始终保持稳定增殖。肝细胞功能相关蛋白表达IF结果显示,与3DC模型和2D细胞相比,白蛋白(ALB)、α-1 抗胰蛋白酶(AAT、a1AT)、CYP2E1、CYP3A11 和 MRP2 在 AH 模型中的表达更高。qRT-PCR 结果显示,ALB、AAT、TRF、CK18、Ki-67、FOXA2、HNF4A等肝细胞功能相关基因mRNA表达水平在AH模型中高于3DC和2D细胞。此外,AH模型中上述基因的表达水平与刚分离24h的PMH最接近。AH模型中的PMH存在ICG摄取和释放、糖原胞内的累积、乙酰化低密度脂蛋白的摄取、以及尿素合成和葡萄糖代谢等功能。此外,与对照组相比,AH组中PMH分泌的ALB、a1AT、转铁蛋白和FOXA2浓度更高且分泌时间更久。CYP酶诱导实验显示,AH模型中的PMH对一些已知的诱导剂有反应,如对乙酰氨基酚(CYP1a2、2e1和3a11)、3-甲基胆蒽(CYP1a1、1a2 和 1b1)、利福平(CYP1a1、1a2、1b1 和3a11)、苯妥英钠(CYP1a1和3a11)以及苯巴比妥(CYP1a2、2a4、2e1和3a11)。AH模型中PMH基因表达的诱导水平高于对照组。研究结论:基于3D生物打印构建的免疫微环境模型是研究间质细胞对胆管癌细胞作用的有效方法。3D生物打印肿瘤模型可更好地模拟各种肿瘤类型真实环境,可能成为临床前研究和药物测试的平台,以及动物模型的合适替代方案。利用声学全息术(声镊)构建的体外模型是一种体外原代肝细胞长期培养的可靠方案,模型中细胞能很好地维持细胞原有的特定功能。这一技术在将来的细胞代谢机制研究、药物检测甚至肝脏替代治疗等多个方面具有巨大的应用潜力。