目的:慢性髓性白血病(CML)是骨髓造血干细胞克隆性增殖形成的恶性肿瘤,以髓系过度增殖以及Ph染色体和(或)BCR/ABL融合基因阳性为特征。BCR/ABL基因编码一种持续活化的BCR/ABL P210融合蛋白,该蛋白具有活化的酪氨酸激酶活性,改变了中性粒细胞增殖、凋亡和迁移特征,是慢性髓性白血病发生的中心环节。酪氨酸激酶抑制剂可以在细胞水平上抑制BCR/ABL酪氨酸激酶,选择性抑制BCR/ABL 阳性细胞的增殖和诱导其凋亡,从而彻底改变了慢性髓性白血病治疗的现状。但是依然有部分患者因为疗效不佳或者疾病进展而需要进行治疗调整。干扰素α在酪氨酸激酶抑制剂诞生前曾经是造血干细胞移植以外的最佳选择。干扰素α可以调节基因表达,但具体机制尚不明确。在一些临床研究中干扰素联合酪氨酸激酶抑制剂可以使更多患者实现无治疗缓解。在真实世界的经验中,酪氨酸激酶耐药的患者联合干扰素治疗,具有一定逆转耐药的作用。PI3K/AKT信号通路是最常见的调控肿瘤生长的信号通路之一,受到多种受体的激活,其抑制剂已被证明对多种肿瘤有效。BCR/ABL蛋白可上调多种下游信号通路,其中活性最高的通路是PI3K/AKT。PI3K根据组织分布可分为3种类型,其中| A亚型可被BCR/ABL蛋白激活,进而活化AKT。在酪氨酸激酶抑制剂耐药的患者中,PI3K/AKT通路成为新的靶点。早期研究发现,干扰素α和β可通过结合干扰素受体,调节下游PI3K/AKT通路活性,从而影响细胞增殖。本课题拟证实干扰素可通过调节PI3K表达水平,逆转慢性髓性白血病细胞对TKI类药物的耐药GSK J4现象,并且进一步在体内与体外探索干扰素对于PI3K/AKT信号通路的调控作用。方法:首先,使用伊马替尼溶液缓慢诱导K562耐药细胞株(K562R),并通过CCK-8试剂盒检测K562细胞对于伊马替尼的IC50值。接着,利用伊马替尼、干扰素以及伊马替尼+干扰素分别处理K562R细胞后,利用Realtime PCR实验检测各组细胞的PI3K、AKT和BCR-ABL mRNA相对水平,利用Western Blot购买Pidnarulex实验检测各组细胞的PI3K、AKT和BCR-ABL蛋白表达水平,利用CCK-8实验检测各组细胞的增殖活力,利用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。然后,通过尾静脉注射K562R建立小鼠慢性髓性白血病耐药模型,比较各组小鼠的生存期以及脾大情况,并采用HE染色法观察各组小鼠脾脏白血病细胞浸润情况,采用免疫组化染色法比较各组小鼠脾脏目标分子的表达情况。再利用shRNA敲降K562R细胞的PI3K水平,利用Realtime PCR实验检测各组细胞的PI3K、AKT和BCR-ABL mRNA相对水平,利用Western Blot法检测各组细胞的BCR-ABL、PI3K、AKT蛋白表达水平,利用CCK-8实验检测各组细胞的增殖活力,利用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。最后,利用慢病毒过表达K562R细胞的PI3K水平,利用Realtime PCR实验检测各组细胞的PI3K、AKT和BCR-ABL相对水平,利用Western Blot实验检测各组细胞的BCR-ABL、PI3K、AKT蛋白表达水平,利用CCK-8实验检测各组细胞的增殖活力,利用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。共同验证干扰素通过抑制PI3K/AKT信号通路逆转慢性髓性白血病对伊马替尼的耐药作用。结果:成功通过伊马替尼溶液诱导出K562耐药细胞株K562R,利用CCK-8实验检测其对伊马替尼的IC50值为221.82nM。相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组BCR-ABL相对mRNA水平明显降低,干扰素组BCR-ABL相对mRNA水平降低,伊马替尼组BCR-ABL相对mRNA水平无统计学差异;相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组PI3K相对mRNA水平明显降低,干扰素组PI3K相对mRNA水平降低,伊马替尼组PI3K相对mRNA水平无统计学差异;相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组AKT相对mRNA水平明显降低,干扰素组AKT相对mRNA水平降低,伊马替尼组AKT相对mRNA水平无统计学差异。相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组BCR-ABL蛋白表达水平明显降低,干扰素组BCR-ABL蛋白表达水平降低,伊马替尼组BCR-ABL蛋白表达水平无统计学差异;相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组PI3K蛋白表达水平相明显降低,干扰素组PI3K蛋白表达水平降低,伊马替尼组PI3K蛋白表达水平无统计学差异;相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组AKT蛋白表达水平明显降低,干扰素组AKT蛋白表达水平降低,伊马替尼组AKT蛋白表达水平无统计学差异。相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组K562R细胞增殖能力明显降低,干扰素组K562R细胞增殖能力降低,伊马替组K562R细胞增殖能力无统计学差异。相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组K562R细胞凋亡率明显上升,干扰素组K562R细胞凋亡率上升,伊马替尼组K562R细胞凋亡率无统计学差异。相较于NC组,伊马替尼+干扰素组小鼠生存期显著延长,干扰素组小鼠生存期有所延长,而伊马替尼组小鼠生存期无明显统计学差异。相较于NC组,伊马替尼+干扰素组小鼠脾脏大小和重量显著下降,干扰素组小鼠脾脏大小及重量有所下降,而伊马替尼组小鼠脾脏大小及重量无明显统计学差异。HE染色结果显示:相较于NC组,伊马替尼+干扰素组小鼠脾脏白血病细胞数显著减少,干扰素组小鼠脾脏白血病细胞数减少,而伊马替尼组小鼠脾脏白血病细胞数显著减少无明显统计学差异。免疫组化染色结果显示:相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组BCR-ABL蛋白表达水平明显降低,干扰素组BCR-ABL蛋白表达水平降低,伊马替尼组BCR-ABL蛋白表达水平无统计学差异;相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组PI3K分子表达水平相明显降低,干扰素组PI3K分子表达水平降低,伊马替尼组PI3K分子表达水平无统计学差异;相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组AKT分子表达水平明显降低,干扰素组AKT分子表达水平降低,伊马替尼组AKT分子表达水平无统计学差异。再利用shRNA敲降K562R细胞的PI3K水平。相较于shNC组,shPI3K组PI3K、AKT和BCR-ABL相对mRNA水平明显降低。相较于shNC组,shPI3K组PI3K、AKT和BCR-ABL蛋白表达水平明显降低。相较于shNC组,shPI3K组K562R细胞的增殖活力显著降低。相较于shNC组,shPI3K组K562R细胞的凋亡率显著升高。最后利用慢病毒过表达K562R细胞的PI3K水平。相较于Vector+生理盐水组,PI3K+生理盐水组的PI3K mRNA相对水平明显升高,Vector+干扰素组的PI3K mRNA相对水平明显降低,而PI3K+干扰素组的PI3K mRNA相对水平无明显统计学差异;相较于Vector+生理盐水组,PI3K+生理盐水组的AKT mRNA相对水平明显升高,Vector+干扰素组的AKT mRNA相对水平明显降低,而PI3K+干扰素组的AKT mRNA相对水平无明显统计学差异;相较于Vector+生理盐水组,PI3K+生理盐水组的BCR-ABL mRNA相对水平明显升高,Vector+干扰素组的BCR-ABL mRNA相对水平明显降低,而PI3K+干扰素组的BCR-ABL mRNA相对水平无明显统计学差异。相较于Vector+生理盐水组,PI3K+生理盐水组的PI3K蛋白表达水平明显升高,Vector+干扰素组的PI3K蛋白表达水平明显降低,而PI3K+干扰素组的PI3K蛋白表达水平无明显统计学差异;相较于Vector+生理盐水组,PI3K+生理盐水组的AKT蛋白表达水平明显升高,Vector+干扰素组的AKT蛋白表达水平明显降低,而PI3K+干扰素组的AKT蛋白表达水平无明显统计学差异;相较于Vector+生理盐水组,PI3K+生理盐水组的hepatic macrophagesBCR-ABL蛋白表达水平明显升高,Vector+干扰素组的BCR-ABL蛋白表达水平明显降低,而PI3K+干扰素组的BCR-ABL蛋白表达水平无明显统计学差异。相较于Vector+生理盐水组,PI3K+生理盐水组的细胞增殖活力明显升高,Vector+干扰素组的细胞增殖活力明显降低,而PI3K+干扰素组的细胞增殖活力无明显统计学差异。相较于Vector+生理盐水组,PI3K+生理盐水组的细胞凋亡率明显降低,Vector+干扰素组的细胞凋亡率明显升高,而PI3K+干扰素组的细胞凋亡率无明显统计学差异。结论:干扰素能够通过抑制PI3K/AKT信号通路以逆转伊马替尼对慢性髓性白血病的耐药作用。