背景:嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)疗法已在血液肿瘤治疗中取得了显著的疗效,但在实体瘤治疗中却进展缓慢。相较于T细胞,巨噬细胞不仅具有较强的肿瘤组织浸润能力,PCR Equipment而且能够通过抗原提呈作用进一步启动适应性免疫应答,因而在癌症治疗中具有更广阔的应用前景。目前多项临床试验证实巨噬细胞在肿瘤治疗中具有良好的安全性,基于自体外周血来源的CAR-巨噬细胞(CAR-macrophages,CAR-M)疗法也已进入Ⅰ期临床试验。然而,鉴于外周血来源巨噬细胞数量有限、体外难以扩增且对基因操作具有天然抵抗性,因此难以满足大规模临床治疗的需求。人多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)具有自我更新和多向分化潜能,且易于进行基因编辑,为“现货型”CAR-M的制备提供了可能。当前,hPSCs分化产生CAR-M的相关研究尚处于早期阶段,现有分化方法存在周期长、产量低和细胞功能差等难题。如何高效地将hPSCs诱导分化为具有强抗肿瘤活性的CAR-M是hPSC-CAR-M疗法临床转化的关键。目的:本研究拟建立周期短且产量高的hPSCs单层分化体系,以在体外高效地产生大量功能性巨噬细胞,并在此基础上利用血液瘤和实体瘤模型验证hPSC-CAR-M的抗肿瘤活性,并探索进一步增强hPSC-CAR-M抗肿瘤疗效的方法。方法:(1)构建hPSCs单层造血分化体系用于高效地产生巨噬细胞;(2)利用显微镜观察、流式细胞术、实时荧光定量PCR、瑞氏-姬姆萨染色、体外吞噬实验、荧光共聚焦显微成像技术、体外诱导巨噬细胞极化实验和细胞因子分泌实验鉴定hPSCs分化所得巨噬细胞的形态和功能;(3)通过RNA测序绘制hPSCs定向巨噬细胞分化过程Decitabine生产商的动态基因表达谱;(4)利用慢病毒转染结合流式细胞分选技术获得稳定表达靶向CD19 CAR的CAR-hPSCs并高效诱导CAR-hPSCs定向hPSC-CAR-M分化;(5)通过体外肿瘤细胞共培养实验结合流式细胞术和共聚焦显微成像技术检测hPSC-CAR-M的抗原特异性抗肿瘤功能;(6)通过血液瘤和实体瘤异种移植小鼠模型验证并优化hPSC-CAR-M的体内抗肿瘤能力;(7)腹腔灌洗回收并检测hPSC-CAselleckchemR-M和T细胞体内活化状态。结果:(1)开发了一种基于单层的体外诱导hPSCs产生功能性巨噬细胞的高效分化体系。该分化体系显著提高了巨噬细胞的分化效率,可在较短的时间(3周)内诱导单个hPSC产生约6000个巨噬细胞,比已往报道的分化效率提高了约100倍。(2)hPSCs来源巨噬细胞类似外周血巨噬细胞,具有表型和功能的可塑性,且具有强吞噬活性。(3)绘制了 hPSCs定向巨噬细胞分化过程中细胞命运转变的基因表达图谱,同时阐述了外周血来源巨噬细胞与hPSCs来源巨噬细胞的基因表达特征。(4)利用慢病毒转染获得特异性靶向CD19的具有强抗肿瘤活性的hPSC-CAR-M,同时证明了传统的一代CAR相较于二代CAR能够显著提高hPSC-CAR-M的抗肿瘤活性。(5)利用淋巴瘤异种移植小鼠模型,对hPSC-CAR-M的体内抗肿瘤疗效进行验证和优化,发现单磷酰脂质A(MPLA)和干扰素γ(IFN-y)体内注射可以激活hPSC-CAR-M,从而发挥抗肿瘤功能。(6)利用淋巴瘤异种移植小鼠模型,发现在体内激活hPSC-CAR-M的同时联合T细胞输注,可进一步增强抗肿瘤疗效。(7)通过乳腺癌异种移植小鼠模型验证了协同激活固有-适应性免疫反应对hPSC-CAR-M抗实体瘤疗效的增强作用。结论:本研究提供了可显著提升hPSC-CAR-M分化效率和抗肿瘤活性的可行性策略:建立了 hPSC-CAR-M高效分化体系;通过体内持续输注MPLA+IFN-γ可激活固有免疫反应,增强hPSC-CAR-M的抗肿瘤疗效;联合T细胞输注可激活适应性免疫应答,并进一步增强hPSC-CAR-M的抗肿瘤疗效。