虫媒病毒是指由蚊子、蜱虫和其他节肢动物媒介传播的传染性病毒,包含多种引起人兽共患病的病毒,对人类和动物健康造成重大威胁。自21世纪初以来,两种新发/再发蚊媒病毒——寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)和基孔肯雅病毒(Chikungunya Virus,CHIKV)的流行导致全球疫情的暴发,造成数以百万计人次感染,对世界公共卫生带来巨大挑战。针对以上两种病毒感染,目前并无疫苗及抗病毒药物上市,迫切需要发现和开发针对病毒的特异性高效抗病毒药物。通过从大批量药物库中快速筛选鉴定抗病毒药物是一种十分有效的手段。本研究构建了以ZIKV复制子细胞系为基础的抗病毒药物筛选平台,并利用该平台从FDA药物库中筛选出一种有效的候选抗病毒药物;利用本LXH254浓度实验室建立的CHIKV-Δns P3-e GFP抗病毒药物高通量筛选平台,我们对不同的小分子化合物库进行筛选,成功从2244种化合物中筛选出6种有效的抗CHIKV病毒的抑制剂,并进一步对2种有应用前景的化合物进行了初步的抗病毒作用机制研究。本研究为ZIKV和CHIKV的新药研发提供技术和理论支持,对这两种重要虫媒病毒的抗病毒药物研发具有重要意义。本论文的第一部分是以ZIKV复制子细胞系为基础的抗病毒药物筛选体系方面的工作。将PAC-2A-Rluc-2A片段替换结构蛋白基因Medicine storage插入到ZIKV病毒基因组的5’UTR和NS1之间构建了含双报告基因的ZIKV复制子(ZIKV-Pac-Rlucrep),构建的带有嘌呤霉素筛选基因及Rluc报告基因的ZIKV复制子可有效复制及蛋白表达,且Rluc信号可有效表征复制。通过嘌呤霉素筛选,建立了稳定表达高水平ZIKV复制子的细胞系。通过优化条件建立了基于复制子细胞的高通量药物筛选体系,并用几种已知的黄病毒复制抑制剂进一步验证了优化的高通量药物筛选体系,最后利用该高通量药物筛选体系对FDA药物库进行了筛选,获得了一种有效的候选药物。ZIKV复制子细胞系的获得为深入研究ZIKV的复制机制提供了平台,同时高通量抗病毒药物筛选系统的建立为老药新用及新药物研发提供了平台基础和技术支持。本论文的第二部分是以基于减毒的报告病毒CHIKV-Δns P3-e GFP的高通量药物筛选平台为基础,对不同的药物分子库进行筛选,并对得到的候选药物进行抗病毒活性验证。首先通过对两种药物库中的2244种药物进行筛选,选择药物抑制率大于90%的药物为初步候选药物。经过第一轮的初筛及第二轮野生型病毒抑制作用验证和细胞毒性检测,共从上述2种药物库中筛选出6种无明显毒性、且对野生型CHIKV有抑制作用的药物。我们选择四种抑制效果较好的药物在CHIKV致病模型C57BL/6小鼠上进行检测,发现sorafenib及Chlorhexidine HCL(CHL)在小鼠体内可有效抑制CHIKV感染,病毒血症及足部关节肿胀减弱明显,说明这两种药物具有良好的成药潜力。因此我们对sorafenib及CHL这两种药物的抑制作用进行了进一步深入研究,发现sorafenib及CHL对CHIKV的抑制不具有细胞依赖性,同时这两种药物对不同株系的CHIKV以及多种甲病毒属病毒均具有明显抑制效果,提示具有发展为广谱抗甲病毒抑制剂的可能,具有较好的应用前景。论文的第三部分在以上研究的基础上,我们对sorafenib及CHL的抑制机制进行了进一步研究。我们首先对sorafenib及CHL可能作用的生命周期阶段进行了检测,发现sorafenib主要作用于CHIKV的复制阶段,而CHL作用于CHIKV感染的多个阶段,包括早期翻译阶段、复制阶段等。我们进一步对sorafenib及CHL两种药物进行了耐药株的筛选,以期通过耐药位点明确药物的作用靶点。经过药物的持续作用,获得了针对两种药物的耐药病毒株,我们对耐药株进行测序及功能验证发现,ns P2-N437H+ns P3-90aa以及ns P1-P249L突变可有效提高病毒的复制效率,E2-H351P-K337M-E1-A392V可提高病毒的进入能力。根据文献报道,sorafenib可阻断细胞RAF MEK/FG-4592使用方法ERK介导的信号通路,提示CHIKV的复制和感染可能与MAPK信号通路相关。我们通过进一步实验发现,CHIKV感染可促进MAPK信号通路的活化,且活化程度与CHIKV的复制效率相关,MAPK信号通路的抑制剂可有效抑制CHIKV感染复制。综上所述,我们在两种药物库中筛选到了两种在细胞和动物水平均发挥抑制作用的药物sorafenib和CHL,并且机制研究表明sorafenib作用于病毒的复制阶段、靶向ns P2及ns P3,且与MAPK信号通路相关;CHL作用于病毒的多种阶段,靶向ns P1和E蛋白。以上研究结果表明sorafenib和CHL有望老药新用,发展为广谱的抗甲病毒抑制剂。