历史上,RNA病毒曾多次引发人类、动物公共卫生事件,如1918年西班牙大流感、2003年非典、2014年西非埃博拉疫情以及最近的COVID-19等,其严重威胁了人类生命健康,阻碍了社会经济的发展。由于RNA病毒变异能力强,导致相关疫苗、药物研发难度大。本研究关注了两种典型的新发RNA病毒,发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)和新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-Co V-2),围绕其与宿主的互作机制展开了相关研究。SFTSV是2009年在中国首次发现的一种新型蜱传布尼亚病毒,其分布广,致病率高,且发病率呈现逐年上升的趋势。SARS-Co V-2引发的COVID-19疫情更是肆虐全球,对世界公共卫生和经济体系造成严重冲击。虽然关于这两种病毒感染的分子机制已有很多研究,但是具体致病机制仍不明晰,有待进一步的研究。病毒-宿主互作的研究不仅可能加深对病毒感染机理的理解,也可能拓展对宿主响应与调控机制的认识,进而可能为靶向宿主的抗病毒干预策略研发提供新线索。本论文主要对宿主因子DDX1(DEAD-box RNA helicase 1)与上述两种新发RNA病毒(特别是病毒核衣壳蛋白)的相互作用开展了一系列功能与机理的研究。核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)是病毒的关键结构蛋白,参与病毒转录复制,并且可能参与调节宿主蛋白和一些生物学过程,或者反过来被宿主调节,从而影响病毒感染和发病的进程,是开发抗病毒研究的热门靶点之一。DDX1是一种依赖于ATP的RNA解旋酶,除了参与RNA代谢外,还可能正向或负向调控多种病毒复制。目前,DDX1与SFTSV和SARS-Co V-2的互作关系尚不清楚。基于此,我们以病毒关键结构蛋白N为切入点,研究了N与宿主的相互作用组,重点解析了宿主因子DDX1与N互作的功能与机理。具体内容如下:本研究首先关注了SFTSV与宿主因子DDX1的相互作用。我们通过过表达、敲低、敲除实验,证明了DWatch group antibioticsDX1是一种SFTSV的宿主限制因子,抑制了病毒复制和蛋白表达。机制研究发现,DDX1的C端结构域可能是抗SFTSV活性的关键结构域,且DDX1抗SFTSV活性可能不依赖其ATP酶和RNA解旋酶活性。在DDX1敲除的细胞系中,SFTSV诱导的IFN-β和TNF-α水平更低,提示DDX1可能通过诱导天然免疫反应来抑制SFTSV。同时对SFTSV与DDX1相互作用进行分析,发现DDX1以一种不依赖于RNA的方式与N相互作用,且DDX1的D1结构域可能是与N互作所必需的。微基因组报告系统实验,表明DDX1可能影响RNP活性,提示DDX1可能也可以直接靶向N,影响N的功能,从而抑制SFTSV。本研究还观察到DDX1与SFTSV的依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp)以及非结构蛋白(non-structural protein,NSs)存在相互作用,说明selleck HPLCDDX1与SFTSV之间的相互作用较为复杂,并非只依赖于N。NSs作为SFTSV一个重要毒力因子,免疫荧光结果显示,NSs劫持DDX1到包涵体中,这可能干扰DDX1抗病毒功能,具体的机理有待进一步研究讨论。总结来说,DDX1可能是通过诱导干扰素响应以及直接靶向SFTSV N等病毒复制机器蛋白两个途径发挥抗SFTSV功能,同时SFTSV可能利用NSs劫持DDX1到“包涵体监狱”中,逃逸DDX1的抗病毒功能,两者之间相互博弈。本研究同时还以SARS-Co V-2 N蛋白为研究对象,通过高特异性亲和纯化(S-pulldown)结合液相质谱分析(LC-MS)建立了SARS-Co V-2 N相互作用组。生物信息学分析表明,这些宿主因子主要参与翻译调控、病毒转录、RNA过程、应激反应、蛋白质折叠和修饰、炎症/免疫信号通路等,与N在病毒感染中的作用相符。通过生信分析和文献检索,挖掘了这些宿主因子中可能存在的药物靶点和靶向药物,生成了药物-宿主蛋白网络。并据此筛选鉴定了一种新的抗病毒小分子药物anisomycin,发现其可以有效抑制SARS-Co V-2Lapatinib小鼠复制,呈现剂量依赖效应,IC50为6.785μM,且细胞毒性低,CC50大于1000μM。此外,实验发现宿主因子DDX1可能与N多个结构域存在相互作用。功能丧失实验表明,DDX1可能是一种有效的抗SARS-Co V-2宿主因子,抑制病毒复制和蛋白表达。这些数据进一步描述了N与细胞的相互作用,可能为理解SARS-Co V-2感染、致病提供了新的线索,并可能有助于开发新的候选治疗方法。综上,本研究以新发RNA病毒SFTSV和SARS-Co V-2为研究对象,分析了这些病毒的关键结构蛋白N与宿主的相互作用,重点解析了宿主因子DDX1通过与N互作进而可能调控病毒感染的功能与机理。此外,还根据病毒N-细胞互作的认识,筛选鉴定了潜在的抗新冠病毒药物。本研究拓宽了对宿主因子DDX1功能的认识,加深了对SFTSV和SARS-Co V-2与宿主互作机制的理解,可能为后续药物、疫苗研发提供了理论基础。