目的炎症、血管生成和骨重塑是多发性骨髓瘤骨髓微环境中三个重要的生物过程,在多发性骨髓瘤的发病机制和疾病进展中发挥重要作用。基于临床对于多指标联合检测的需求,开发临床应用型的多重蛋白质生物标志物定量检测试剂具有重要意义。本研究采用稳健灵敏、操作简便的多重微球流式荧光免疫技术平台开发细胞因子、血管生成因子、骨重塑分子的定量检测试剂,并在复发难治性多发性骨髓瘤(Relapse/refractory multiple myeloma,RRMM)样本中进行验证,分析RRMM患者的细胞因子、血管生成、骨重塑蛋白表达水平的变化。方法评估流式荧光免疫技术使用的双色荧光编码微球的区分能力和羧基修饰水平的均一性。基于双抗体夹心法开发多重蛋白标志物的定量检测试剂,进行捕获抗体偶联浓度、检测抗体浓度、交叉反应测试、稀释液筛选等免疫分析的优化。并进行免疫分析的验证,方法学评价包括灵敏度、准确度、稀释线性和精密度。在55例RRMM患者和22例健康对照样本中进行临床应用,分析患者的细胞因子(IL-1β、IL-2gastroenterology and hepatology、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 p70、IL-17、TNF-α、IFN-γ)、炎症标志物(血清淀粉样蛋白A1[Serum amyloid A1,SAA1])、血管生成因子(血管内皮生长因子[Vascular endothelial growth factor,VEGF]和金属蛋白酶组织抑制剂1[Tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1])和骨重塑分子(Dickkopf相关蛋白1[Dickkopf-related protein Z-IETD-FMK1,DKK1]、核因子kappa-B受体活化因子配体[Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL]和骨保护素[Osteoprotegerin,OPG])表达水平变化,及其与临床特征DS、ISS分期、M蛋白水平等的相关性。结果十种细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 p70、IL-17、TNF-α、IFN-γ)、VEGF、DKK1、RANKL、OPG的分析灵敏度在0.2～25.3 pg/m L,平均灵敏度为6.8 pg/m L。中丰度蛋白SAA1和TIMP1的灵敏度分别为2700.0 pg/m L、46.0 pg/m L。开发的16种指标的回收率在67.1%～125.8%,平均回收率为98.6%。除IL-2、IL-4、IL-8、DKK1外,其余指标的回收率均在可接受范围80%～120%内。16种指标的平均线性度为127.8%,IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、SAA1、TIMP1、VEGF的线性度较好,线性度在90.3%～115.8%。16种指标的批内变异系数低于8.3%,平均批内变异系数为4.2%;批间变异系数低于15.1%,平均批间变异系数为10.2%,具有良好的精密度。与健康对照相比,RRMM的IL-1β、IL-2、IL-4、IFN-γ、SAA1、DKK1、RANKL、OPG、RANKL/OPG水平升高,IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、VEGF水平下降,IL-12、TNF-α、TIMP1水平差异无统计学意义。VEGF水平与细胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α水平呈正相关(r值分别为0.39、0.36、0.50、0.57、0.47、0.28、0.49)。RRMM患者的IL-2、IL-17、DKK1、RANKL、OPCX-5461使用方法G水平与Ig G型单克隆蛋白呈正相关(r值分别为0.41、0.54、0.55、0.50、0.53),TIMP1水平与Ig G型、Ig A型单克隆蛋白均呈正相关(r值分别为0.59、0.61)。结论本研究开发了16种具有较高灵敏度和特异性的蛋白标志物定量检测试剂,建立的多重检测试剂开发流程对于今后拓展蛋白标志物多重检测试剂的研发和应用具有重要的参考价值。此外,本研究发现IL-2、IL-17、DKK1、RANKL、OPG水平与Ig G型骨髓瘤的M蛋白,TIMP1水平与Ig G、Ig A型骨髓瘤的M蛋白水平具有良好的相关性,具有追踪疾病进程的潜在价值。