橄榄来源的天然酚类化合物羟基酪醇,因其强抗氧化活性和抗癌保护特性而对人体有益,被广泛的应用于食品,医药保健品和化妆品等领域。目前报道的化学合成和天然提取获得羟基酪醇的方法仍存在较多的不足,相对而言,生物转化法具有绿色可持续,反应工艺简单,底物特异性高,不依赖于金属催化剂等优点,逐渐成为合成天然产物羟基酪醇的有利工具in vivo infection。在这项研究中,我们设计并重建了一条新型的四酶级联系统,将L-氨基酸氧化酶(LAAD)、α-酮酸脱羧酶(Pm KDC)、醛还原酶(Yah K)和葡萄糖脱氢酶(GDH)的基因共同于Escherichia coli BL21(DE3)内表达,使3,4-二羟基苯基丙氨酸(L-DOPA)依次通过脱氨、脱羧和还原反应最终转化为羟基酪醇。GDH的作用则是催化葡萄糖脱氢以实现辅因子NADH的再生,而NADH是Yah K催化合成羟基酪醇必需的氢供体。随后采取不同拷贝数质粒组合的策略来协调途径内酶的表达,以实现LAAD,Pm KDC,Yah K和GDH在级联反应中发挥出较好的协调性。本论文主要研究内容及结果如下:(1)多酶级联途径内酶的选择和体外验证。采用实验室前期筛选的来源于Cosenzaea myxofaciens的LAAD;来源于Proteus mirabilis JN458的Pm KDC;来源于Escherichia coli BL21的Yah K和来源于Bacillus subtilis ATCC 13952的GDH作为级联路径的酶催化剂。首先使用LAAD,Pm KDC,Yah K和GDH的酶提取液进行体外级联反应,HPLC法检测羟基酪醇的产生情况,证明了级联路径的可行性。(2)共表达E.coli重组工程菌株的构建及酶的表达水平优化。将aad L,pmkdc,yahk和gdh基因以双质粒共同表达的策略整合于E.coli BL21(DE3)内,以调节酶的相对活性同时平衡反应速率。成功构建了9株重组菌,确定Pm KDC为本途径最主要的限速酶,最终9株菌株中HTG7(E.coli BL21(DE3)/p RSF-aad L-pmkdc-yahk/p ET-gdIDN-6556化学结构h)内的各酶表达协调性最佳,www.selleck.cn/products/canagliflozin全细胞催化剂在4 h内催化生成的羟基酪醇的最高产量为36.40mmol·L~(-1)。(3)对重组菌株培养和转化条件进行系列优化。确定最优培养基组成为:15 g·L~(-1)甘油,25 g·L~(-1)酵母膏,20 g·L~(-1)蛋白胨,1.5 g·L~(-1)硫酸镁,2.2 g·L~(-1)磷酸二氢钾,9.4 g·L~(-1)磷酸氢二钾;最优诱导表达条件为:开始诱导的菌体浓度OD_(600)为0.8,IPTG诱导浓度为0.4 mmol·L~(-1),诱导温度为20℃;最优转化条件为:NAD~+浓度为0.3 g·L~(-1),温度为30℃,p H为7.0,湿菌体浓度为35 g·L~(-1),转速为200 r·min~(-1)。经系列优化后,羟基酪醇的产量提升至45.27 mmol·L~(-1)。随后,最适条件下,在5 L发酵罐内扩大生产羟基酪醇,最终在8 h内从60.91 mmol·L~(-1)的L-DOPA合成了56.85 mmol·L~(-1)(8.75 g·L~(-1))的羟基酪醇,时空生产率为1.1 g·L~(-1)·h~(-1)。最后利用乙酸乙酯多次萃取反应液,有机相经旋转蒸发仪蒸馏后得到色谱纯度较高的羟基酪醇,乙酸乙酯对羟基酪醇的萃取率高达95.9%。