随着人口老龄化比例的增长,神经退行性疾病已成为社会主要健康问题之一。神经退行性疾病主要包括阿尔茨海默症、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、肌萎缩侧索硬化症和多发性硬化症等。这些疾病伴随衰老而产生渐进性的神经细胞死亡,导致患者的认知、情绪和运动功能逐渐退化。氧化应激在神经退行性疾病的发展中起着至关重要的作用,当患者处于氧化应激状态时,体内氧化与抗氧化作用失衡,中性粒细胞炎性浸润,蛋白酶分泌增加,产生大量氧化中间产物。为了对抗氧化性细胞损伤,通过清除活性氧恢复氧化还原平衡的抗氧化治疗被认为是一点击此处种极具前景的方法。内源性抗氧化酶如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶能够有效清除活性氧,其中超氧化物歧化酶(SOD)是金属酶,广泛存在于生物体内,能够特异性地将超氧阴离子转化为O_2和H_2O_2,保护机体免受氧化损伤。然而,超氧化物歧化酶的高免疫原性、不稳定性和低半衰期限制了其在生物医学应用范围。为了解决这些问题,研究人员开发了一系列的化学修饰方法和递送系统。化学修饰能够提高酶的稳定性,但化学修饰可能会改变酶的结构,造成酶活性的丧失。一系列的合成载体如脂质、聚合物和无机纳米颗粒成功开发并用于超氧化物歧化酶的递送,然而合成载体体内应用需要克服诸多障碍,包括循环系统及肝肾中吞噬细胞系统的捕获及快速清除作用等。因此,开发超氧化物歧化酶递送体系,以延长体内循环时间、降低免疫原性和提高疗效,是一项极具挑战性的研究课题。外泌体是CX-5461生产商粒径为30-150 nm的内源性囊泡,通过大多数哺乳动物细胞的细胞膜融合释放,其具有良好的生物相容性、低免疫原性和生理条件下的高稳定性,已经作为药物递送系统备受关注。此外,外泌体具有透过血脑屏障的能力,因此,以外泌体为载体,担载超氧化物歧化酶递送,有望在神经退行性疾病的抗氧化治疗中发挥积极的作用。本论文的主要研究内容及结果如下Immune activation:1.SOD@EXO的构建及抗氧化活性评价活性氧(ROS)是具有未配对电子的原子团,通常参与氧化还原反应,并表现出强烈的氧化特性。适度的活性氧促进细胞增殖,刺激吞噬细胞杀死细菌,而过量的活性氧能够诱发脂质过氧化和DNA变性。本研究中,我们以HEK293细胞作为外泌体供体细胞,通过超速离心法分离外泌体;通过机械挤出结合皂素渗透的方式将超氧化物歧化酶担载进外泌体,制备纳米递送体系SOD@EXO。透射电镜结果表明,SOD@EXO纳米复合物呈现均一规则的球形结构,粒径均一。在1-甲基-4-苯基吡啶(MPP~+)诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤模型中,MTT实验和Live/dead细胞染色实验表明SOD@EXO能够有效提升细胞存活率;DCFH-DA探针检测胞内ROS实验表明SOD@EXO具有胞内抗氧化作用效果,清除胞内过量ROS;Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡实验表明SOD@EXO能够抑制细胞凋亡,保护SH-SY5Y细胞免受损伤。同时,以N2野生型秀丽隐杆线虫为模型,SOD@EXO在线虫体内半衰期更长,显著延长线虫的寿命;线虫体内SOD活性和ROS含量检测验证了SOD@EXO的处理提升线虫体内SOD酶活性,清除过量ROS;线虫对热应激和氧化应激的抗性实验证明了SOD@EXO的处理提升线虫在恶劣环境下的生存率;油红O染色实验表明SOD@EXO的处理能够有效地减少线虫中的脂肪累积,改善线虫的健康状况。最后,q PCR实验验证了SOD@EXO对生长激素/胰岛素样生长因子-1信号通路介导的基因表达表现出更有效的调节作用,进而促进了线虫寿命的延长。总之,外泌体介导超氧化物歧化酶递送能够清除活性氧并延缓线虫的衰老,为治疗ROS相关疾病提供了理论依据。2.外泌体介导SOD和纳米酶鼻内递送治疗帕金森病的研究帕金森病是最常见的中枢神经系统运动障碍疾病,它的发生和发展与活性氧的过量产生高度相关。因此,利用抗氧化酶降低细胞内的活性氧水平缓解神经元的退化和损伤,有望成为治疗帕金森病的有力工具。除天然酶SOD外,许多纳米酶具有良好的抗氧化活性、高稳定性和低成本的特点,其中Ce O_2纳米酶具有良好的过氧化氢酶活性备受学者的广泛关注。因此,SOD和Ce O_2纳米酶能够以级联方式清除活性氧,有望产生更为显著的抗氧化活性及疾病治疗效果。本研究中,我们通过水热法制备了Ce O_2纳米酶。高分辨率透射电镜图片显示,合成的Ce O_2纳米酶呈现均一的球形结构。我们将Ce O_2纳米酶与上一章制备的SOD@EXO混合,构建SOD@EXO+Ce O_2给药系统。结果显示,透射电镜下SOD@EXO+Ce O_2的Ce O_2纳米酶附着在SOD@EXO周围,也同时游离在SOD@EXO外。SOD@EXO+Ce O_2在体外具有良好的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性,蛋白免疫印迹实验表明SOD载药量为12.18%;体外血脑屏障模拟实验证明FITC-SOD@EXO能够穿过内皮细胞单层,说明其具备穿过血脑屏障的能力;激光共聚焦显微镜分析表明,外泌体能够有效介导SOD被神经细胞充分摄取。以MPP~+诱导SH-SY5Y细胞构建PD模型,MTT实验和Live/dead细胞染色实验表明SOD@EXO+Ce O_2的抗氧化作用显著提升细胞存活率;DCFH-DA探针检测胞内ROS实验表明外泌体介导SOD与CAT的级联催化能够有效清除活性氧;线粒体膜电位检测实验表明表明SOD@EXO+Ce O_2的递送能够有效缓解由MPP~+所诱导的线粒体膜电位下降现象,保护线粒体功能;细胞蛋白免疫印迹实验表明SOD@EXO+Ce O_2处理后上调线粒体凋亡途径相关蛋白和酪氨酸羟化酶表达水平,降低了α-突触核蛋白表达水平。同时,与静脉注射相比,该体系经鼻内给药后能够更好地绕过血脑屏障,实现酶分子在脑部的分布。在MPTP诱导的PD小鼠模型中,该体系能够改善小鼠运动障碍。在小鼠组织层面上,该体系缓解神经炎症,抑制相关氧化应激指标,有效恢复了PD相关酪氨酸羟化酶的表达水平,继而提高纹状体内多巴胺的含量,最终对帕金森病产生良好的治疗效果。3.外泌体介导SOD和硫酸软骨素酶ABC鼻内递送治疗多发性硬化症的研究多发性硬化症是最常见的中枢神经系统自身免疫性疾病,以不可逆的神经轴突损伤为特征,其病理特征包括神经炎症、脱髓鞘、胶质细胞增生和免疫系统失调。为了研究多发性硬化症的发病机制和治疗方法,研究人员构建了病理特征相似的实验性自身免疫性脑脊髓炎模型(EAE模型)。在实验性自身免疫性脑脊髓炎的进展中,脑部被激活的小胶质细胞产生过量的ROS、促炎症细胞因子和趋化因子。此外,被激活的星形胶质细胞和少突胶质细胞分泌硫酸软骨素蛋白多糖,形成胶质瘢痕,进而导致轴索神经病变和脱髓鞘。因此,抑制神经炎症和促进髓鞘再生是治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的有效策略。本研究中,我们将SOD和硫酸软骨素酶ABC(Ch ABC)担载进外泌体,制备纳米递送体系SOD/Ch ABC@EXO。结果表明,纳米粒径电位仪检测SOD/Ch ABC@EXO纳米复合物的水合动力学直径为101.2±0.6 nm;SOD担载量及包封率检测证明外泌体成功实现了两种酶分子的共担载,SOD/Ch ABC@EXO具有良好的超氧化物歧化酶和硫酸软骨素酶活性。激光共聚焦显微镜表明BV2细胞在6 h时能够有效摄取SOD/Ch ABC@EXO;在脂多糖刺激BV2细胞构建的炎症细胞模型中,SOD/Ch ABC@EXO能够高效清除ROS并抑制细胞凋亡。鼻内给药后,SOD/Ch ABC@EXO能够在脊髓和大脑中大量分布。在EAE小鼠模型中,SOD/Ch ABC@EXO显著下调了EAE小鼠的神经功能评分,改善小鼠的神经功能。脊髓组织层面上,SOD/Ch ABC@EXO通过上调抗氧化酶SOD活性和抑制脂质过氧化,有效降低了EAE小鼠的氧化应激损伤;病理切片水平上SOD/Ch ABC@EXO表现出良好的神经炎症调节活性及再髓鞘化,减轻了脊髓炎性细胞浸润现象。最后,q PCR实验验证SOD和Ch ABC的联合递送降低了脊髓组织炎症细胞因子表达,升高了抗炎细胞因子表达。总之,SOD/Ch ABC@EXO纳米复合物在实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗中具有广阔的前景。综上,本研究以天然来源的外泌体为载体,构建了一类高效、安全的抗氧化酶递送体系,同时鼻内给药的方式使该体系能够有效绕过血脑屏障实现抗氧化酶在中枢神经系统的分布,在神经退行性疾病的动物模型中获得了良好的治疗效果。以上研究,为抗氧化酶的组装与递送搭建了良好的平台,进而为基于酶分子构建重大疾病纳米递送体系提供了新的设计思路。