目的:膜性肾病(Membranous nephropathy,MN)是全球导致成人非糖尿病特发性肾病综合征的最常见原因,目前临床主要治疗药物存在药物耐受、肝肾损伤等副作用,预后较差。临床研究发现火把花根片(Colquhounia Root Tablets,CRT)对于MN具有较好疗效但其药效物质基础和作用机制尚不明确。本研究旨在探究CRT对于MN的治疗效果及作用机制,并进一步对CRT关键候选成分的“效益-风险”进行体外评价,指导临床合理用药。方法:(1)该部分研究将干湿实验相结合,首先对CRT干预MN的靶点进行网络分析预测,通过文献检索CRT主要化学成分,使用TCMIP数据库及Swiss Prediction网站收集相应成分靶标,并运用TCMIP数据库收集MN疾病靶标。基于STRING数据库构建“疾病-药物”互作网络,计算筛选关键网络靶标,进而进行GO和KEGG通路富集分析。随后建立体内外MN模型,以观察CRT对阳离子化牛血清白蛋白MN小鼠及C5b-9损伤小鼠足细胞的治疗作用,并在体外实验中通过TNF-α抑制剂英夫利昔单抗进一步验证CRT对通路蛋白的影响。应用酶联免疫吸附法动态检此网站测各组小鼠24小时尿蛋白量以及治疗结束后小鼠血清中白蛋白、胆固醇、肌酐、TNF-α、IL-6、MMP-9及MPC-5细胞上清中TNF-α、IL-6、MMP-9含量;六胺银染色法观察小鼠肾基底膜病变;免疫荧光法检测小鼠肾小球IgG、C3蛋白表达及MPC-5细胞F-actin蛋白表达;免疫组化法检测小鼠肾小球中Nephrin及Podocin蛋白表达;免疫印迹法检测MPC-5细胞中Nephrin和Podocin蛋白,以及MPC-5细胞和小鼠肾脏中JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白的表达水平。(2)在明确CRT对MN的治疗作用后,进一步对CRT关键候选成分进行评价,考察其对人正常肝细胞L-02、人类风湿成纤维样滑膜细胞MH7A、人肾小管上皮细胞HK-2和小鼠足细胞MPC-5活性的影响。transrectal prostate biopsy采用酶联免疫吸附法考察各组炎症诱导MH7A细胞和葡萄糖诱导HK-2细胞模型中炎性因子的水平;采用蛋白免疫印迹法检测药物对MPC-5细胞模型中Nephrin和Podocin蛋白异常表达的干预作用,并开展免疫荧光检测考察对MPC-5细胞骨架蛋白表达水平的调节。通过TCMIP v2.0数据库获得CRT入血成分候选靶点,利用GEO数据库收集类风湿关节炎、糖尿病肾病、MN疾病靶点,基于STRING数据库构建“疾病基因-药物靶标”互作网络,进行通路富集分析。最后利用Auto Dock Vina分子对接方法探究雷公藤甲素和雷公藤红素与关键通路中相应靶标的结合能力。结果:(1)CRT可通过免疫、代谢、氧化和细胞周期四个功能模块作用于MN,其中TNFα/IL6-JAK2/STAT3-MMP9信号通路相关度较高。实验结果显示,CRT可降低MN小鼠24小时尿微量白蛋白、血清肌酐及总胆固醇含量,升高血清白蛋白,减少肾小球毛细血管襻免疫沉积物,增加足细胞特异性蛋白的表达,并调节通路相关蛋白表达,从而维持足细胞结构,恢复肾小球滤过率,改善肾脏功能。反向验证实验进一步明确了CRT对TNFα/IL6-JAK2/STAT3-MMP9信号通路的调节作用,表明CRT可通过该通路治疗MN。(2)雷公藤红素、表儿茶素、雷公藤内酯酮均可降低MH7A及HK-2细胞上清炎性因子浓度,增加MPC-5细胞标志性蛋白含量,其中,表儿茶素对细胞无明显的毒性作用。“疾病基因-药物靶标”关联网络挖掘结果表明,CRT可能通过调节PI3K/HIF1α/NOS2信号通路干预类风湿关节炎、MN、糖尿病肾病。结论:(1)CRT对于MN具有较好疗效,可通过调节TNFα/IL6-JAK2/STAT3-MMP9信号通路改善肾脏功能,缓解肾脏及足细胞损伤,干预MN的发生及发展。该研究结果为CRT的临床适应症拓展提供了实验基础,拓展了雷公藤属中药的临床治疗范围。(2)作为CRT关键候选成分,表儿茶素效益较高而风险更小,雷公藤红素及雷公藤内酯酮效益较佳但风险较高。网络挖掘结果表明PI3K/HIF1α/NOS2信CL 318952供应商号通路可能是CRT干预类风湿关节炎、糖尿病肾病和MN的关键环节和途径,该研究结果为CRT的质量标准提升以及进一步研发提供了实验参考。