甜樱桃(Prunus avium Linn.)属蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)果树,因其果实成熟早、品质优而备受人们青睐,近年来在南方被广泛引种栽培。嫁接是甜樱桃苗木繁育的主要方式,贵州引种发现,北方砧木表现欠佳,因此培育本地的适宜砧木迫在眉睫。贵州拥有丰富樱桃(Cerasus pseudocerasus)资源,为甜樱桃砧木的选育提供了原始材料。前期从野生樱桃中选育出一个红皮株系,嫁接甜樱桃表现出良好的亲和性,植株抗涝性增强,半矮化。前人的研究多集中于嫁接口细胞结构及嫁接后嫁接苗生理生化水平变化,而砧木对甜樱桃接穗分子水平上的调控机制少有报道,尤其是microRNA(miRNA)参与的分子调控。为更好地理解miRNA调节接穗矮化的机制,本研究以贵州“红皮”(正常砧)及“青皮”(矮化砧)野生樱桃为砧木,选取嫁接在两种砧木上接穗顶芽及叶片为材料,采用小RNA组及降解组测序等技术,对甜樱桃miRNA及靶基因进行全基因组水平鉴定,探究miRNA-mRNA调控甜樱桃接穗生长发育的分子调控机制,旨在为甜樱桃砧木的选育提供理论依据。主要研究结果如下:1.甜樱桃miRNAs及phasiRNAs的全基因组鉴定利用两种砧木嫁接甜樱桃接穗的顶芽、叶片共12个sRNA文库及叶片降解组文库,从全基因组水平对甜樱桃miRNAs及其靶基因进行鉴定。共鉴定到178个已知miRNAs和39个novel miRNAs,包括48个已知miRNAs家族成员及35个novel miRNAs家族成员。根据miRNAs家族成熟序列一致性来看,除miRN482之外,大部分已知miRNA家族保守性较高。从30个已知miRNA家族(98个成员)和10个novel miRNA家族(11个成员)中,共获得170个靶基因。共获得183个phasiRNA位点,通过对phasiRNA介导子分析发现,甜樱桃中存在植物中保守的phsiRNA途径:miR393-TIR/AFB、miR482-NB-LRR、miR858/828-MYB和miR7122-PRR等,还发现特有的phsiRNA途径:miRN3-PHAS85-NAC、miRN10-PHAS42、miRN22-PHAS59和miRN11-PHAS146。2.差异表达miRNAs筛选以正常砧甜樱桃接穗顶芽(ZCB)为对照,矮化砧接穗顶芽中(YCB)显著下调表达miRNAs共有4个,包括miR171c-3p、miR2118-3p、miR171h-3p和miR159a-3p;显著上调表达miRNAs主要包括miR166a/b/c/e/d、miR164a-5p及miR394a/b/c等。叶片样品中有25个显著差异表达miRNAs,包括5个novel miRNAs和20个已知CP-690550说明书miRNAs。矮化砧接穗叶片(YCL)中显著下调表达miRNAs有miR171h-3p、miR159b-3p、miR319c-3p和miR398c-3p;而显著上调的有miR396b-5p、miR393b-5p、miR827-3p和miR858a等。差异表达miRNAs靶基因GO富集结果显示,顶Conus medullaris芽和叶片中分别富集到18和14个GO term;KEGG富集结果显示,顶芽和叶片均富集到植物激素信号转导通路。差异表达miRNA靶基因有四类,涉及茎尖分生组织相关、与茎伸长相关、植物激素合成与信号转导、营养元素平衡等,折射出砧木对接穗生长的复杂miRNA调控网络。3.PavmiR171h及靶基因Pav SCL6功能验证系统发育进化分析显示,各物种间miR171前体序列存在着较大遗传变异,甜樱桃PavmiRNA171前体与桃miR171具有最近的亲缘关系;全基因组水平鉴定获得45个GARS基因,包括3个HAM亚类转录因子;对HAM亚类基因系统VX-765 NMR发育进化分析发现,可分为两个亚类且起源于裸子植物与被子植物分离之后,双子叶植物中保留了HAMⅠ类同源基因,但单子叶植物只有HAMⅡ亚类基因;克隆获得了PavmiR171h茎环前体序列109 bp,超表达PavmiR171h转基因拟南芥株系株高显著高于野生型;克隆Pav SCL6基因ORF全长2,310 bp,编码769个aa,亚细胞定位显示定位于细胞核;转Pav SCL6基因拟南芥通过抑制赤霉素合成基因At GA3OX1、At GA3OX2、At GA20OX1和At GA20OX2的表达导致转基因植株矮化;酵母单杂交及双荧光素酶实验明确了Pav SCL6基因与甜樱桃Pav GA3OX3基因启动子结合并抑制基因的表达。4.PavmiR159b及靶基因Pav MYB33功能验证不同物种miR159成熟序列高度保守,含有“UUGGAUUGAAGGGAGCUC”核心序列,且与靶基因结合位点保守;克隆PavmiRNA159b前体193 bp,转基因株系生长势显著优于野生型;克隆Pav MYB33基因ORF全长1,680 bp,编码559个aa,转Pav MYB33拟南芥促进了细胞水解酶基因的表达,抑制了植株营养生长且与Pav MYB33表达量呈正相关。综上所述,本研究探明了miRNAs通过调节茎顶端组织的发育,植物激素合成与信号转导,以及营养元素的吸收与平衡等过程影响甜樱桃接穗的发育;证明了PavmiR171h-Pav SCL6及PavmiR159b-Pav MYB33调控模块分别通过调控赤霉素合成及水解酶基因表达而抑制植物营养生长,初步揭示了miRNAs参与甜樱桃接穗生长的分子调控。