目的:基于肺巨噬细胞对肺上皮细胞源外泌体的应答效应探讨麻杏石甘汤抗A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)的作用机制。方法:(1)流感病毒诱导肺上皮细胞损伤模型的建立:通过IAV诱导小鼠肺上皮细胞(Mouse lung epithelial cells,MLE-12),CCK8法检测不同干预时间的细胞活性,明确IAV诱导细胞损伤的最佳条件。其次通过流式细胞术检测细胞凋亡,实时定量PCR(qRT-PCR)和蛋白印迹(Western blot)法检测炎症细胞因子的表达水平。(2)流感病毒诱导的肺上皮细胞源外泌体(Exsomes,Exo)对巨噬细胞的损伤机制:通过超高速离心法提取MLE-12细胞源外泌体,采用透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)、Western blot进行鉴定;其次构建MLE-12细胞源外泌体与巨噬细胞共培养体系并检测巨噬细胞的应答效应;然后采用高通量测序表征流感病毒诱导的MLE-12细胞源外泌体特异性miRNA及预测靶基因和信号通路GPCR & G Protein抑制剂;最后筛选出来的miR-1249-5p进行验证,以及通过对巨噬细胞转染miR-1249-5p,检测其靶基因和相关信号通路的表达情况。(3)麻杏石甘汤通过调节miR-1249-5p抑制流感病毒诱导的级联细胞损伤作用:首先采用CCK8法检测麻杏石甘汤含药血清的安全剂量和对流感病毒刺激MLE-12细胞的治疗剂量;其次,以IAV诱导的MLE-12细胞损伤模型为干预对象,实验分空白对照组、模型组、麻杏石甘汤含药血清低、高剂量组以及奥司他韦组,给予相应干预方式8 h后收集上清,提取外泌体,NTA检测各组外泌体的粒径分布和浓度,qRT-PCR法检测各组外泌体中miR-1249-5p表达水平;最后,将上述各组外泌体与巨噬细胞共培养,qRT-PCR法检测巨噬细胞中miR-1249-5p表达水平,qRT-PCR和Western blot法检测巨噬细胞中溶质携带家族4成员1(Solute Carrier Family 4 Member 1,SLC4A1)靶点和核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路的基因及重要功能蛋白的表达。结果:(1)构建稳定的流感病毒诱导肺上皮细胞损伤模型:根据CCK8结果显示IAV干预8h的细胞活性最符合本研究需要,以此条件干预MLE-12细胞,流式细胞术检测其凋亡率明显升高;qRT-PCR和Western blot检测流感病毒核蛋白(Nuclear Protein,NP)和肿瘤坏死因子-α(Tumor nercrosisHerpesviridae infections factor-α,TNF-α)和白介素-6(Interleukin-6,IL-6)的表达水平显著升高。(2)明确了流感病毒诱导的肺上皮细胞源外泌体对巨噬细胞的损伤机制:采用超高速离心法提取的外泌体鉴定符合外泌体表征;荧光显微镜观察发现外泌体能够进入巨噬细胞内,并且外泌体可以促进巨噬细胞炎症因子的分泌;高通量测序检测出外泌体miR-1249-5p,并聚焦于miR-1249-5p和其靶基因SLC4A1和NF-κB通路。巨噬细胞成功转染miR-1249-5p模拟物以及抑制剂,Western blot法检测miR-1249-5p能够抑制靶基因SLC4A1和NF-κB通路的表达。(3)麻杏石甘汤通过调节miR-1249-5p抑制流感病毒诱导的级联细胞损伤作用:CCK8结果显获悉更多示10%和20%的麻杏石甘汤含药血清无细胞毒性,且抑制IAV诱导MLE-12细胞损伤;NTA检测各组外泌体粒径无明显变化,而浓度有所改变;qRT-PCR结果表明IAV刺激的MLE-12细胞源外泌体miR-1249-5p表达明显降低,麻杏石甘汤高、低剂量组和奥司他韦组的表达显著升高。共培养后的巨噬细胞中miR-1249-5p表达与MLE-12细胞源外泌体相一致;qRT-PCR和Western blot结果显示模型组巨噬细胞SLC4A1和NF-κB通路基因和蛋白的表达显著升高,麻杏石甘汤高、低剂量组和奥司他韦组的表达显著下降。结论:流感病毒通过肺巨噬细胞对MLE-12细胞源外泌体的应答效应诱导急性细胞损伤,而麻杏石甘汤可以增加外泌体miR-1249-5p的传递以抑制SLC4A1和NF-κB信号通路从而改善IAV诱导的炎症反应。