目的:先天性甲状腺功能低下(CH)是一种常见可预防的致儿童智力低下的内分泌疾病,由85%甲状腺发育不全(TD)和15%激素合成障碍(TDH)引起。若患儿未得到明确诊断和及时治疗,则在儿童期会出现不可逆的生长发育落后和智力缺陷。多数TD病例分子遗传机制未清晰,存在未发现的新基因突变。课题组用全外显子重测序关联分析在587例TD中发现NOTCH2为新候选致病基因。现以斑马鱼为模式动物,通过构建基因敲降模型和基因敲除模型观察notch2对斑马鱼甲状腺发育的影响,对notch2致病机制做初步探讨。方法:(第一部分)通过向斑马鱼胚胎注射靶向吗啉环(Morpholino,MO)构建notch2基因敲降模型,提取整体胚胎蛋白GDC-0068 IC50并使用Western blotting技术检测MO基因敲降的效果,随后收集不同时期的胚胎进行后续实验。采用CRISPR/cas9技术构建斑马鱼notch2基因敲除模型,使终止密码子提前出现从而沉默基因的表达,并通过斑马鱼的传代及使用T7酶切的方式筛鱼获得突变体。(第二部分)随后在构建成功的模型上进一步进行实验,采取荧光活体成像技术观察基因敲降后tg转基因斑马鱼甲状腺的发育状况;提取不同时期整体胚胎RNA利用q PCR技术进行甲状腺相关基因m RNA表达的影响;利用斑马鱼整体胚胎原位杂交技术观察甲状腺转录因子pax2a空间表达的影响。选取基因敲除杂合突变体notch2~(+/-)1月龄的斑马鱼进行RNA-seq,获得差异表达基因的信息后进行生物信息学分析,包括GO及KEGG富集分析。结果:(第一部分)Western blotting结果显示注射了以atg为靶位点的MO(atg-MO)的胚胎中notch2蛋白的表达量明显降低,说明atg-MO的注射成功敲低了斑马鱼胚胎notch2蛋白的表达,基因敲降模型构建成功。斑马鱼突变体notch2~(+/-)的测序结果显示突变体的notch2发生移码突变,从而导致终止子提前出现,后续序列全部沉默,达成了基因敲除的目的。(第二部分)荧光活体成像的结果显示注射atg-MO的斑马鱼胚胎的甲状腺存在发育不良及异位等现象,通过分析荧光强度发现,100hpf、5dpf及6dpf时期的斑马鱼胚胎TG的表达有显著差异。q PCR的结果显示,在notch2敲降后斑马鱼发育至24hpf,pax2a的表达显著上调,tg及tshba显著下调;在36hpf,pax2a、tg、tshba及thrb均出现显著下调;在48hpf,hhex显著上调,而nis则出现下调趋势;在72hpf,tg及thra均出现下调趋势;在96hpf,nkx2.1a及pax2a均出现上调趋势。原位杂交的结果显示,notch2的敲降会影响24hpf及36hpf的斑马鱼胚胎pax2a的时空表达,进而影响甲状腺的发育。基因敲除杂合突变体notch2~(+/-)的转录组测序结果显示,一共发现了232个差异基因,其中130个基因表达上调,102个基因表达下调,其中包括CH致病基因DUOX2的同源基因duox,notch信号通LGK-974纯度路相Spontaneous infection关基因her1、her11、bbs1和dtx2,差异基因主要被富集在细胞凋亡、细胞衰老及吞噬体等相关的信号通路上,蛋白功能主要与MHC及抗原的加工与呈递相关。结论:(1)notch2缺失会导致斑马鱼甲状腺发育不良。(2)notch2存在调控甲状腺发育和甲状腺激素代谢的可能,在不同时期发挥不同的作用。(3)notch2的敲除可能影响了CH致病基因duox的表达,从而导致了CH的发生。