盐胁迫是植物面临的重要非生物胁迫之一,严重影响包括烟草在内的作物品质与产量,进而影响了烟叶生产的经济效益。深入研究烟草等植物响应高盐胁迫的分子调控机制,对利用基因工程提高植物耐盐性具有重要意义。非特异性脂质转移蛋白(Non-specific lipid transfer proteins,nsLTPs)通常具有保守的结构相似性、低序列统一性,在植物生长和抗逆性方面具有广泛生物学功能。在课题组已经获得的过表达NtLTPI.38株系(OE)和敲除株系(ntltpI.38)的基础上,通过转录组、代谢组和脂质组联合分析,结合盐胁迫后形态结构、生理变化、物质代谢的研究,探究NtLTPI.38基因响应盐胁迫的分子机制。主要研究结果如下:1.正常生长条件下野生型株系K326(WT)与转基因株系的非靶向代谢组学分析表明:在OE vs ntltpI.38、ntltpI38 vs WT以及OE vs WT不同比较组中注释了 699、608和573种差异代谢物。其中,类黄酮物质(Flavnoids)在所有差异代谢物中比例最大,分别有74、51和54个差异代谢物。Types of immunosuppression3个组别中,分别有47、17和26个上调代谢物。过表达NtLTPI.38株系中类黄酮物质上调的数量均高于野生型和敲除株系。KEGG富集分析发现,三个组别均富集到甘油磷脂代谢(Glycerophospholipid metabolism)、三羧酸循环(Citrate cycle,TCA cycle)和花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)。而在ntltpI38 vs WT 和 OE vs WT 组别中,KEGG代谢通路均富集在乙醛酸和二羧酸代谢(glyoxylate and dicarboxylate metabolism)、亚油酸代谢(linoleic acid metabolism)和嘌呤代谢(purine metabolism)途径中。2.非靶向脂质代谢组分析表明,基于OE vs ntltpI.38、ntltpI.38 vs WT和OE vs WT 比较分别注释了 28、32和19种差异脂质代谢物。其中,过表达株系中三酰基甘油(TGs)含量显著高于野生型和敲除株系。而神经酰胺(Cer)[如Cer(d42:4)和Cer(d44:4)]含量显著低于K326和敲除株系。此外,过表达株系中PC:PE的比率显著高于敲除株系。对差异脂质代谢物KEGG富集分析发现,在三个组别的比较中,差异脂质代谢物主要富集在甘油磷脂代谢(Glycerophospholipid metabolism)和甘油脂代谢(glycerolipid metabolism)途径。3.转录组分析表明,在OE vs ntltpI.38、ntltpI.38 vs WT和OE vs WT 比较组别中,分别发现4812、4253和4223个差异表达基因。其中,205个为三个组别共有差异表达基因。进一步对差异表达基因进行GO和KEGG分析发现,GO主要在蛋白质磷酸化(protein phosphorylation)和蛋白激酶活性(protein kinase activity)、DNA 模板化(regulation of BIBW2992 MWtranscription,DNA-templated)中富集。这些差异表达基因主要注释为钙调磷酸酶B样蛋白(CBL)、CBL相互作用蛋白激酶(CIPK)、钙依赖性蛋白激酶样蛋白(CDPK)以及转录因子。此外与盐胁迫下Ca2+信号传导有关的基因,包括FERONIA(FER),膜联蛋白(ANN),细胞壁相关激酶(WAK),呼吸爆发氧化酶同系物D(RbohD)和脱落酸受体;离子转运通道蛋白相关基因,如K+转运蛋白(AKT)、高亲和力K+AG-221分子式转运蛋白(HKT)、Na+(K+)/H+反转运蛋白(NHX)、环核苷酸门控通道(CNGCs)和氯离子通道(CLC)基因也在不同株系间差异表达。在KEGG富集分析中甘油磷脂代谢(Glycerophospholipid metabolism)和甘油脂代谢(glycerolipid metabolism)途径与代谢组学和脂质组学相对应。4.通过不同组学联合分析,构建了NtLTPI.38基因调控类黄酮物质和脂类物质基因表达和物质代谢的代谢调控网络图。NtLTPI.38基因通过参与三羧酸循环、乙醛酸和二羧酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、甘油磷脂代谢和甘油脂代谢途径,调控脂质代谢物合成。通过参与莽草酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途径,调控类黄酮物质变化。5.对野生型和转基因烟草株系进行200 mM NaCl盐胁迫处理,结果发现,高盐胁迫下,过表达株系表现出更强的耐盐性。盐胁迫后,与野生型和敲除株系相比,过表达NtLTPI.38基因提高了烟草叶片的叶绿素含量、K+含量、Ca2+含量、可溶性糖和可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、总黄酮含量、DPPH、ABA含量、抗氧化酶活性,降低了烟草叶片的相对电导率、Na+含量、Cl-含量、H2O2含量、O2·-含量、MDA含量,表明NtLTPI.38基因可以通过提高烟草渗透调节能力、抗氧化能力、维持细胞离子稳态能力和ABA激素含量等来增强烟草的耐盐性。综上所述,NtLTPI.38可以通过调节脂类物质含量,调控Ca2+信号和ABA信号传导、离子通道蛋白相关基因的表达,增加类黄酮物质合成等机制来提高盐胁迫下烟草的抗氧化能力、维持细胞离子稳态,从而提高烟草的耐盐性。