目的 基于响应面法对四氢嘧啶羟化酶(ectoine hydroxylase, EctD)催化反应体系进行优化，以四氢嘧啶(Ectoine, Ect)为底物，以温度、酸碱度和Ect、EctD浓度为影响因素，利用Box-Benhnken实验法研究各因素及其交互作用对EctD体外催化反应效率的影响，以期获得EctD体外催化合成5-羟基四氢嘧啶(5-Hydroxyectoine, 5-HE)的最优条件。方法 分别以Ect浓度、温度和酸碱度为自变量，在1 mM Fe~(2+)、10 mM α-酮戊二酸(α-ketoglutarate)和10 mM TES缓冲液及EctD液组成的反应体系中反应25 min后，利用高效液相色谱仪(HPLC)检测5-HE的合成量，得到各单因素对酶催化反应的影响情况，并利用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析；Etoposide以单因素实验结果为基础，选择X1(温度)、X2(酸碱度)、X3(Ect浓度)、X4(EctD浓度)为影响因素，以5-HE合成量Mindfulness-oriented meditation为响应值，设计4因素3水平响应面Box-Benhnken实验29组，每组实验重复3次，其数据以平均值±标准差表示，并用Design-Expert 12.0软件进行统计分析。结果 单因素实验结果显示，EctD在体外催化5-HE的合成量随着酸碱度和温度的增加呈现先升高后降低趋势，当酸碱度为7、温度为35℃时5-HE合成量达到最高值；而Ect浓度在1.25～1.5 mM时，5-HE的合成量无明显变化，说明此时底物Ect与酶催化中心的结合达到饱和。通过Box-Benhnken实验得到的回归方程及结果的方差分析表明，该模型的F为9.41,P<0.0001,失拟项P为0.0634,说明回归方程可信。回归方程一次项系数绝对值的大小依次为X4(EctD浓度)>X3(Ect浓度)>X1(温度)>X2(酸碱度),说明X4(Liproxstatin-1EctD浓度)是影响EctD催化合成5-HE的显著因素，而X2(酸碱度)对其影响较小。与此同时，X1(温度)与X4(EctD浓度)的交互作用对酶催化反应也具有显著影响。结论 EctD体外催化合成5-HE的最优反应条件：温度为35℃、pH为7、Ect浓度为1 mM、EctD浓度为0.6 U/mL、Fe~(2+)浓度为1 mM、α-ketoglutarate浓度为10 mM。温度是影响酶催化的主要外界因素。