五味子甲素是从中药五味子中提取出的联苯环辛烯型木脂素,具有神经保护活性,但是其作用靶标和作用机制尚未阐明。我MLN8237核磁们采用基于活性的蛋白质分析Dibutyryl-cAMP体外技术(activity-based protein profiling,ABPP)揭示五味子甲素的神经保护作用的靶标与机制,为后续相关研究提供参考。首先基于五味子甲素的构效关系,我们设计并合成了 4个五味子甲素光亲和性探针,通过生物活性评价和光标记能力测试后,获得一个生物活性较好且具有良好标记效率的探针P2。之后,我们从探针浓度、孵育时间、紫外光照时间三个方面优化了蛋白标记实验条件,并且通过竞争性实验验证了探针P2与五味子甲素作用于相同靶标。基于ABPP原理,我们利用探针P2在人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y Human Neuroblastoma,SH-SY5Y)垂钓五味子甲素的直接作用靶蛋白,通过液质联用技术和非标定量法,鉴定到13个高可信度蛋白,结合生物信息学分析和文献调研,最终确定YKT6 v-SNARE同系物(Synaptobrevin homolog YKT6,Ykt6)为五味子甲素的潜在靶蛋白。之后,通过Pull down/WB实验、免疫荧光共定位实验、细胞热迁移分析验证了五味子甲素与Ykt6的直接相互作用,利用表面等离子共振实验进一步测定二者之间的KD值为14.6Toxicological activity μM。五味子甲素是首次发现的作用于Ykt6的小分子。功能验证实验中,通过Ykt6敲低实验和自噬流实验,进一步证实Ykt6是五味子甲素发挥神经保护活性的重要靶点。五味子甲素通过作用于Ykt6调节自噬从而保护细胞免受过量谷氨酸诱导的细胞损伤。本课题利用ABPP技术首次发现五味子甲素的直接作用靶标Ykt6,验证了二者之间的相互作用并初步探索五味子甲素通过Ykt6发挥神经保护活性的作用机制。这一发现为后续五味子甲素的神经保护作用研究提供参考,并可能为神经保护治疗提供新的策略。