无机焦磷酸酶(PPase)是一种在镁离子存在下催化焦磷酸盐(PPi)水解成两个磷酸分子(Pi)的酶,该酶通过防止焦磷酸盐与镁沉淀提高体外转录(IVT)反应的速率,现已成为RNA制备的重要组成部分。m RNA疫苗制备及RNA的生化表征研究通常需要大规模生LGK-974临床试验产RNA,IVT反应需要消耗大量PPase。此外,PPase还广泛应用于PCR增强反应、工业糖生产和基因测序等实验与工业生产中。目前,对来源于大肠杆菌与酵母中PPase的应用研究较多,但对嗜热菌PPase催化结构域的研究报道较少。本文基于以上问题,采用定点突变手段改造嗜热菌PPase,以观察PPase催化结构域中多个氨基酸改变对酶学性质及其活性的影响,进一步表征和鉴定PPase催化结构域,同时完成了嗜热PPase的重组表达、中试发酵及纯化方案,主要研究内容如下:嗜热无机焦磷酸酶野生型的氨基酸序列来自NCBI蛋白数据库,同时我们设计了12个不同位点变化的突变体。经密码子优化后通过大肠杆菌表达系统进行重组表达,重组蛋白经过SDS-PAGE与Western Blot鉴定分子量约为21k Da。筛选得到重组酶最适表达条件为诱导温度25℃、IPTG浓度0.3m M、诱导时间8h。确立了5L发酵罐的中Adoptive T-cell immunotherapy试工艺,使用LB发酵培养基,全过程发酵12h即可得生物量积累63.93mg/m L。收获大批量菌体破碎,通过75℃加热30min去除表达宿主蛋白。对重组嗜热无机焦磷酸酶纯化本文提供两种纯化方案,一种以镍柱亲和层析、Capto Q阴离子交换层析、S100分子筛层析为主的柱层析方法,另一种为采用聚乙烯亚胺(PEI)沉淀后通过高盐溶液逐级洗脱得到蛋白。基于柱纯化和高分子聚合物PEI的纯化过程都取得较好的纯化效果,获得了纯度较高,核酸残留低的嗜热无机焦磷酸酶重组蛋白。嗜热无机焦磷酸酶的活性通过钼蓝比色法测定反应体系中游离Pi浓度间接测得。重组酶最适反应温度为75℃,最适p H为9,反应过程中的最适二价金属离子为Mg~(2+),Na F与MDP都会对酶活性产生抑制,且反应过程中高浓度的PPi与Mg~(2+)也会抑制酶的活性。重组嗜热无机焦磷酸酶具有极高热稳定性,在100℃孵育5h,仍能保持其最大催化活性的80%左右,且适宜浓度的Mg~(2+)与重组PPase共同热孵育,可进一步维持酶的热稳定性。测定重组酶水解PPi的动力学参数K_m值与V_(max)分别为1.008m M、1.793m M min~(-1)。将重组酶添加到PCR扩增体系中,可以明显解除过多PPi对PCR扩增造成的抑制作用,在IVT反应中添加重组嗜热无机焦磷酸酶可以提高产物量。无机焦磷酸酶的催化过程是由其活性中心的关键残基、二价金属离子、水分子协同作用的结果。对大肠杆菌PPase的研究发现,部分Asp残基通过金属配位连接四个Mg~(2+)离子,底物通过静电相互作用与Lys29、Lys142和Arg43结合,Asp67促进桥接水分子脱质子,由这些氨基酸组成了高度保守的金属催化笼。通过多序列对比、进化树分析、保守性分析及同源建模,确定了嗜热PPase的活性中心,与其他家族I型PPase相似,都由13-17个关键氨基酸组成,基于残基的电性与功能对K30、D43、R44、Y56、D66、D71、D103、Y140进行定点突变与组合突变,制备并表征了嗜热PPase的12个突变体,结合结构模拟发现,突变体Y56K、D71N、D103N由于空间距离的变化以及氢键的减少,降低了对底物或Mg~(2+)的亲和力,导致其催化活力完全丧失。K30R的变化使得催化产物的解离变得困难;D66作为M1与M2及PPi共同作用的残基,D66N降低了活性位点的总负电荷,降低了其与二价金属离子的结合能力;Y140K使得侧链与底物距离的增大而不易结合,最终K30R、D66N、Y140K分别保留野生酶活性的57%、11%、13%。D43N、D43E、R44K分别保留活性的96%、93%、97%,该位点残基的变化对酶活影响不大。对于多点突变的K30R D66N、Y56K D66N以及K30R Y56K D66N同样使得酶活完全丧失。测定各突变酶的米氏常数,多数突变酶的K_m值增大,突变导致酶对底物的亲和力减弱,转化数较野生型都有所降低,酶活力显著下降。本文通过对野生型PPase关键位点氨基酸改变而获得多个突变体理化性质及催化功能影响的研究,首次确定了Y56、D71、D103在酶催化结构域中的重要作用,为设计在不同条件下活性和稳定性增强的酶提供有力https://www.selleck.cn/products/Lapatinib-Ditosylate.html证据,本研究结果有助于理解PPase的酶学性质和结构与功能关系。