【目的】上皮性卵巢癌因早期诊断medical curricula困难、高复发性及转移性,因此其预后差。外泌体及其内容物与恶性肿瘤的外渗、免疫逃逸等密切相关,其可作为恶性肿瘤早期诊断的潜在标记物。肿瘤微环境是肿瘤生存的细胞环境,它能促进肿瘤进展及促使肿瘤的异质性,肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中的重要组成成分,它能促进恶性肿瘤的血管生成、侵袭迁移等。本研究为探讨不同卵巢组织外泌体m RNAs表达谱的差异,筛选出不同卵巢组织差异性外泌体m RNAs,探究卵巢癌组织来源外泌体对巨噬细胞极化的调节作用以及为上皮性卵巢癌早期诊断、发生发展提供实验数据。【方法】1.收集2021年1月至2022年1月就诊于“云南省肿瘤医院妇科”住院行卵巢切除手术患者的标本。其中对于要求切除卵巢、临床诊断和术后病理诊断明确为子宫平滑肌瘤、子宫腺肌症等患者的卵巢标本,将其纳入正常卵巢组织组收集。2.分离原代上皮性卵巢癌细胞,超速离心法分离提取卵巢组织来源外泌体(正常卵巢组织组、良性肿瘤组、交界性肿瘤组、卵巢恶性肿瘤早期、卵巢恶性肿瘤晚期)、NTA及流式细胞术鉴定外泌体,其中流式细胞术检测外泌体表面标记物CD9。3.卵巢癌外泌体转录组高通量测序,比较分析各组外泌体m RNAs的差异表达;并用GO、KEGG pathway、PPI等生物信息学分析,筛选出差异性基因;蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测不同卵巢分组中外泌体THBS1基因表达水平。4.筛选出的外泌体差异性基因THBS1,在卵巢癌细胞中将其敲降,采用WB检测M1型巨噬细胞标志物CD86和M2型巨噬细胞标志物CD206表达水平。5.通过CCK8实验、细胞划痕实验等探讨卵巢癌外泌体通过THBS1基因调节巨噬细胞极化及促进肿瘤细胞的增殖和迁移。【结果】1.透射电镜下观察不同来源卵巢组织的外泌体,其形态、大小未见明显差异,均呈圆盘状的囊性结构;对不同来源卵巢组织外泌体进行粒径分析,正常卵巢组织组、卵巢良性肿瘤组、卵巢交界性肿瘤组、卵巢恶性肿瘤早期组、卵巢恶性肿瘤晚期组的平均粒径分别为176.3 nm、165.9 nm、174.2 nm、151.7 nm、155.8nm,平均浓度分别为1.5E+11 Particles/ml、7.2E+10 Particles/ml、1.6E+11Particles/ml、1.6E+11 Particles/ml、6.0E+9 Particles/ml,各组间外泌体粒径及浓度差异均无统INCB018424体内实验剂量计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测各组间外泌体标志物CD9均表达阳性,各组间外泌体表面蛋白CD9阳性率差异无统计学意义(P<0.05)。2.高通量测序结果发现,卵巢恶性肿瘤早期组和恶性肿瘤晚期组基因组成相似,卵巢良性肿瘤组和交界性肿瘤组基因组成相似。卵巢良性肿瘤组和正常卵巢组织组比较,共有26条差异表达m RNAs,其中21条表达上调,5条表达下调;卵巢交界性肿瘤组和正常卵巢组织组比较,共有20条差异表达m RNAs,其中18条表达上调,2条表达下调;卵巢恶性肿瘤早期组和正常卵巢组织组比较,共有349条差异表达m RNAs,其中199条表达上调,150条表达下调;卵巢恶性肿瘤晚期组和正常卵巢组织组比较,共有741条差异表达m RNAs,其中501条表达上调,240条表达下调。3.GO分析结果发现各组外泌体相关差异性m RNAs主要涉及多细胞生物过程、细胞增殖与分化、细胞迁移、解剖结构发育、细胞对化学刺激的反应、细胞过程负调控、细胞黏附、SMAD蛋白复合物、糖胺聚糖结合分子、细胞外基质组织、血管生成等。4.KEGG分析发现各组外泌体相关差异性m RNAs主要参与PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、TNF信号通路、TGF-β信号通路、人乳头瘤病毒感染等。5.通过绘制维恩图我们发现卵巢良性肿瘤组、恶性肿瘤早期组、恶性肿瘤晚期组共有差异性基因16个,通过PPI分析预测差异基因m RNAs和相互作用网络,我们最终筛选出与巨噬细胞极化相关的基因为THBS1。6.WB结果显示,THBS1在正常卵巢组织组、卵巢良性肿瘤组、交界性肿瘤组、恶性肿瘤早期组和恶性肿瘤晚期组中表达,其中卵巢恶性肿瘤早期组和恶性肿瘤晚期组表达水平显著高于正常卵巢组织组、良性肿瘤组和交界性肿瘤组(P<0.001)。7.WB结果显示,将差异基因THBS1敲降后,M2型巨噬细胞标志物CD206蛋白表达水平较对照组和空白载体组显著降低(P<0.001),M1型巨噬细胞标志物CD86蛋白表达水平较对照组和空白载体组显著增强(P<0.001)。CCK-8实验发现敲降THBS1基因,卵巢癌细胞增殖活力较空白载体组及对照组显著降低(P<0.001)。细胞划痕实验发现敲降THBS1基因后,卵巢癌细胞迁移能力较空白载体组和对照组降低。【结论】1.不同卵巢组织来源的外泌体浓度、形态无明显差异。2.不同卵巢组织来源的外泌体在成分上存在差异,其中卵巢恶性肿瘤早期组、恶性肿瘤晚期组与正常卵巢组织组比IACS-10759生产商较,m RNAs表达存在显著差异。差异性m RNAs主要涉及p53信号通路、PI3K-Akt信号通路、TGF-β信号通路等。3.卵巢癌源性外泌体THBS1基因促进巨噬细胞向M2型极化。敲降THBS1基因后,巨噬细胞向M1型极化。4.卵巢癌外泌体THBS1基因能促进卵巢癌细胞的增殖和迁移。因此,卵巢癌外泌体THBS1基因的m RNA可能是潜在的早期诊断、促进肿瘤增殖和迁移的分子标志物。目前卵巢癌外泌体通过THBS1基因诱导巨噬细胞向M2型极化的机制尚不清楚,还有待进一步研究。