非洲菊(Gerbera hybrida)是世界五大鲜切花之一,同时也是研究复杂花序发育与进化的模式植物。在抗病品种大量推广之前,化学和生物防治仍是应对非洲菊根腐病的主要手段。印度梨形孢(Piriformospora indica)是一种类丛枝菌根真菌,它作为新型的生物防治剂,已被证明可以提高包括非洲菊在内的多种植物的抗病性。前期研究中,课题组已从生理生化水平上揭示了该有益真菌提高非洲菊根腐病抗性的机制,然而其潜在分子机理尚不明晰。本研究利用高通量测序技术对印度梨形孢定殖处理(PI)、隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)接种处理(PC)、定殖印度梨形孢后接种隐地疫霉处理(PP)和无处理对照(CK)四组非洲菊根系进行了转录组和s RNA组测序,挖掘并研究Puerpal infection了受P.indica调控的抗病防御相关基因和miRNAs以揭示其抗根腐病的分子机制。本研究取得主要结果如下:1.印度梨形孢和隐地疫霉侵染对非洲菊根系转录组的影响从4个比较组中共获得15763个差异表达基因(DEGs)。四个比较组(CK vs PI,CK vs PC,PI vs PP和PC vs PP)共有的30个DEGs中,受P.indica和P.cryptogea诱导显著的基因(LOX、CPK和ROMT等)均与抗病密切相关,暗示它们在非洲菊抵御根腐病侵染过程中发挥着重要作用。GO和KEGG富集结果表明受P.indica显著影响的DEGs主要富集于亚油酸代谢、脂氧化物的生物合成与代谢以及糖类的生物合成等途径;受P.cryptogea显著影响的DEGs主要富集于植物激素信号转导和苯丙烷代谢途径,它们广泛参与防御反应、信号转导和L-苯丙氨酸分解代谢过程。此外,P.indica定殖和P.cryptogea侵染均影响了亚油酸代谢通路中相关基因的转录水平,特别是LOX表现出对两种真菌的积极响应。值得注意的是,CK vs PI、CK vs PC和PI vs PP三组中的DEGs均富集到MAPK信号通路且共同靶向于植物防御素基因(plant defensin,Ceralasertib说明书PDF),表明PDF可能是受P.indica诱导来抵御根腐病菌的关键基因。2.ERF在非洲菊响应P.cryptogea侵染过程中的功能研究P.indica和P.cryptogea均能显著影响转录因子基因的转录水平,其中,AP2/ERF占的比重最大。为明确ERF在根腐病抗性中的作用,对瞬时过表达非洲菊Gh ERF后的烟草叶片进行了接菌处理,3 d后进行组织化学染色并检测相关防卫基因(Nb PR2、Nb PR3、Nb ACO、Nb LOX和Nb PDF1.2)的转录水平。结果显示,在瞬时过表达Gh ERF的烟草叶片中,除Nb PDF1.2表达受抑制外,其余基因表达水平均显著提高。表明GhBMS-907351生产商 ERF可以通过激活JA/ET信号途径增强植物对P.cryptogea的抗性。3.印度梨形孢和隐地疫霉侵染对非洲菊根系sRNA组的影响从4个比较组中获得115个DE-miRNAs(包括30个已知miRNA和85个新型miRNA)。对DE-miRNAs的靶基因(DETs)进行GO和KEGG富集分析发现:CK vs PC组和PC vs PP组的DETs均在植物激素信号转导通路上显著富集,且多数靶基因受miR171和miR393家族调控并分别参与生长素和赤霉素代谢。miR393的表达受P.cryptogea诱导,其可能通过负调控TIR1的表达来增强非洲菊对根腐病的抗性。miR171-SCL模块可能在P.indica诱导的抗病防御反应中扮演重要角色。此外,CK vs PC组中的DETs还涉及到多种转录因子基因。转录组与s RNA组学关联分析发现,19个主要受到miR156、miR397和miR403家族调控的DETs属于DEGs,暗示它们在非洲菊响应根腐病过程中发挥重要作用。4.非洲菊PDF基因家族鉴定及其对根腐病抗性的影响基于非洲菊转录组数据,鉴定并克隆获得9个PDFs,包括4个I类(GhPDF2.1～2.4)和5个II类(GhPDF1.1～1.5)成员。两类防御素在γ核心基序中的带正电荷残基数存在差异。在应答P.cryptogea侵染时,不同类型GhPDF表现出不同的响应模式。大多数I类GhPDFs在感病叶柄中高表达,而所有II类GhPDFs在根部高表达。在PC根中,除GhPDF2.1不表达外,其他GhPDFs在P.cryptogea侵染2 d后均受到显著抑制,但在侵染15 d或18 d后达到最高值。为探究GhPDF1.5(II类防御素)和GhPDF2.4(I类防御素)的抗病机制,基于烟草瞬时转化进行了P.cryptogea抗病评价。病斑面积统计和组织化学染色结果均显示GhPDF2.4的抑菌效果显著优于GhPDF1.5。接种P.cryptogea后,过表达GhPDF2.4的烟草叶片中Nb LOX和Nb ACO的表达量均显著上调,其可能通过改变非洲菊JA/ET途径中相关基因的表达从而快速有效地激活其基本防御。而过表达GhPDF1.5的烟草叶片中抗病相关基因表达量无明显变化,说明两类防御素的作用机制可能存在差异。5.PDF蛋白抗根腐病的机制研究为进一步研究PDF的抗真菌作用,利用原核表达系统诱导并纯化了GhPDF2.4-His重组可溶性蛋白,研究该蛋白的体外抗菌活性及其对P.cryptogea生长的影响,并应用于组培苗中以验证其抗根腐病能力。结果显示,该蛋白在PDA培养基上能够显著抑制P.cryptogea菌丝生长并延缓菌丝膨大体的形成。组培苗的表型观察和半定量测定结果均显示体外施用GhPDF2.4纯化蛋白在P.cryptogea侵染前期有明显缓解根腐病症状的效果,但3 d后则对病原菌的生长并无明显抑制作用,推测可能与蛋白活性逐步降低有关。