全球变暖导致高温胁迫频发,极大地影响了全球作物的产量。棉花作为世界上最为重要的经济作物之一,高温胁迫导致其雄性不育,造成严重减产。因此,深入研究棉花雄性发育过程并解析其响应高温的分子机制,对创制耐高温棉花新种质具有重大意义。本研究利用棉花高温最敏感的四分体时期花药进行了单细胞转录组和单细胞染色质开放性测序,构建了棉花中首张正常条件和高温胁迫下的单细胞水平的花药细胞类型发育全景图,分析了高温胁迫下棉花花药各类细胞的特异表达情况及其表观修饰变化情况,发现了高温下花药的不同组织细胞会共同开启逆境响应相关转录因子的结合基序的染色质,特异关闭发育相关转录因子结合基序的染色质,进而诱发逆境响应基因表达的上调和花药发育特异时期基因下调表达,从而增强对抗高温胁迫的能力。进一步我们揭示出一条在高温胁迫下的棉花雄性育性调控的新途径:即GhMYB66-GhMYB4-GhCKI调控途径,为后续培育抗高温棉花新种质提供了理论基础,具有重要的应用价值。本研究的具体结果如下:(1)常温和高温下棉花花药单细胞转录组和单细胞染色质可及性图谱构建。首先,通过优化细胞核提取过程,摸索出了一种可以快速提取棉花花药高质量细胞核的技术。利用该技术提取了敏高温棉花品系“H05”的常温和高温下四分体时期花药细胞核,分别获得17,732和15,906个高质量细胞,进行了单细胞转录组测序,完成了棉花花药单细胞表达图谱的构建,并成功分检出花药组织中所有的细胞类型,发现棉花花药各层细胞间具有高度的表达异质性。Landfill biocovers通过细胞类型之间的差异表达分析和RNA原位杂交实验,鉴定到了大量细胞类型特异的标记基因,填补了花药中多数细胞类型缺乏标记基因的空白。随后基于表达图谱,对减数分裂细胞、中层细胞、绒毡层细胞分别进行了拟时序分析,重构出了单细胞水平下的减数分裂过程,发现四分体时期绒毡层细胞间的表达也具有明显的异质性,且不同拟时间簇的绒毡层细胞具有不同的生物学功能。通过构建了绒毡层发育过程中转录因子间的调控网络,发现一些在绒毡层发育过程中起重要作用的转录因子如MYB4、MYB52、ZFN1等。此外,根据中层的拟时序和高精度半薄切片结果,提出了棉花中层细胞并不是在减数分裂结束后的第7个时期完成降解,而是在花药发育的第11时期协同绒毡层一起完成降解。进一步,通过正常条件和高温胁迫下的单细胞转录组比较分析,发现花药不同类型细胞对于高温有其独特的响应特性,存在强烈的异质性。其中负责花粉壁合成相关的绒毡层细胞对高温最为敏感,在受到高温胁迫后完全消失,并发现在这些绒毡层细胞中高量表达的GhNSP购买GSK126和GhCYP703A2可能是响应高温的核心关键因子。另一方面,完成了单细胞多组学(转录组+染色质可及性)测序及分析,鉴定了所有细胞类型特异的染色质开放区域,发现了常温和高温下基因的表达均与对应染色质开放活性成高度正相关,而高温下从转录组中消失的绒毡层细胞可能是由于其染色质关闭所导致。最后分析了高温下所有细胞类型中465类转录因子结合基序的染色质可及性变化,发现不同的转录因子家族在不同的花药细胞类型中具有独特的高温响应机制,其中在绒毡层细胞中高量富集的MYB类转录因子的结合基序染色质可及性在高温下呈现强烈的变化,推测MYB类的转录因子对于绒毡层细胞响应高温可能十分关键。(2)GhMYB66-GhMYB4-GhCKI是调节棉花高温下雄性不育的一个关键途径。单细胞转录组鉴定到大量MYB类转录因子对于绒毡层发育十分重要,且单细胞染色质开放性测序发现MYB类转录因子在绒毡层细胞中参与高温响应,深入分析发现MYB类转录因子其中的一个成员GhMYB4(Ghir＿A12G003840)在绒毡层细胞中受高温诱导表达。酵母单杂、双荧光素酶报告实验、凝胶迁移实验表明,GhMYB4可以结合到I型酪蛋白激酶GhCKI基因启动子序列中的两个MYB结合位点上,正向调控GhCKI的转录。在棉花花药发育早期,高温诱导GhMYB4上调表达导致雄性败育,与常温条件下过量表达GhMYB4导致雄性败育表型类似,同时伴随着GhCKI表达的增强。此外,酵母双杂、双分子荧光互补实验、GST-pull down实验表明GhMYB4可以与另外一个MYB转录因子GhMYB66互作。GhMYB66在高温下的表达模式与GhMYB4相似,但其并不能直接结合到GhCKI的启动子上。双荧光素酶报告实验、凝胶迁移实验发现GhMYB4与GhMYB6PS-341 IC506形成的异源二聚体,可以增强GhMYB4与GhCKI启动子的结合能力。此外,分析发现高温减少了si RNA介导的GhMYB4启动子上的CHH类型的DNA甲基化,进而增强了高温下GhMYB4在四分体时期花药中的表达,促进了GhMYB4/GhMYB66异源二聚体的形成,从而提高了GhCKI在绒毡层中的转录,导致雄性败育。综上所述,我们的研究揭示GhMYB66-GhMYB4-GhCKI通路在棉花花药响应高温中具有重要的调控作用。(3)棉花CKI基因的全基因组鉴定、进化估算和功能特征分析。GhCKI是高温下棉花雄性不育的关键枢纽基因,而对棉花CKI家族的系统研究未见报道,因此鉴定棉花中的CKI家族,研究CKI基因的进化历程和功能具有重要的理论价值。通过对陆地棉、海岛棉、雷蒙德氏棉、亚洲棉、草棉五个棉种的CKI基因家族鉴定,分别获得了58、57、31、29、27个CKI基因,并揭示了棉花CKI家族分为type I和type II两大类。通过比较基因组分析发现,两类CKI家族成员随着棉花四倍体事件扩增,最终type I和type II两类CKI基因可能是分化于15亿年前的红藻和绿藻分化时期,因此推测CKI是参与植物一些基础生物学路径的古老基因。进一步从陆地棉CKI家族的表达分析发现,大部分CKI基因的确可以响应光信号和高温胁迫,且有的CKI基因受高温诱导产生可变剪切。该研究提供了全基因组水平下的棉花CKI基因的进化史特征,为进一步研究两类CKI基因在特定发育过程和环境胁迫条件下的功能分化奠定了理论基础。总之,我们的研究首次建立了在常温和高温条件下,棉花四分体花药单细胞水平的转录图谱和染色质开放性图谱,描绘出棉花雄性器官在高温胁迫下单细胞水平的表达和表观变化,鉴定出大量参与花药发育和响应高温的核心基因,挖掘出一条调控棉花高温下雄性不育的一个关键途径,对棉花的功能基因组研究和棉花抗高温育种具有重要促进作用。