单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种重要的食源性人兽共患病原菌,主要通过污染的食物进入宿主消化道。Lm能够在多种表面毒力因子的作用下突破肠道屏障、血胎屏障和血脑屏障,感染后死亡率较高。壁磷壁酸(wall teichoic acid,WTAs)是Lm细胞壁表面的重要阴离子糖biosensing interface类聚合物,通常以多聚磷酸核糖醇(ribitol-phosphate,RboP)长链共价结合到Lm细胞壁的肽聚糖层。WTAs根据RboP主链中是否含有N-乙酰葡糖胺基(N-acetylglucosamine,GlcNAc)分为Ⅰ型WTAs与Ⅱ型 WTAs。WTAs的特异性糖基化修饰是Lm菌体抗原特性和免疫原性的主要决定因素,参与维持Lm细胞稳态,并影响细菌耐药、毒力和宿主免疫应答。Lm Ⅰ型WTAs糖基化修饰与Ⅱ型WTA相比较为简单,仅包含鼠李糖基和GlcNAc。目前,已报道了 WTAs的GlcNAc修饰介导的细菌毒力,但鼠李糖基化修饰的WTAs介导Lm的生物学特性和免疫分子机制仍未完全揭示。本研究构建了血清型1/2a Lm EGD-e的rmlT基因突变株,对其在Lm菌体抗原特性和生长特性等方面的功能进行了研究。同时,提取并纯化了EGD-e和rmlT突变株的WTAs,通过超高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱(UPLC-MS/MS)分析了 WTAs的结构组成。以小肠上皮细胞Caco-2、巨噬细胞RAW264.7和小鼠原代巨噬细胞BMDMs为体外感染模型,C57BL/6N小鼠为体内感染模型,研究了鼠李糖基化修饰的Lm WTAs在细菌侵袭、定殖和宿主炎性因子应答中发挥的功能。本研究有助于揭示WTAs的鼠李糖基化修饰在Lm致病与免疫中的重要作用,为李斯特菌病的防控奠定理论基础。1.壁磷壁酸鼠李糖基转移酶基因rmlT突变株的构建及生物学特性研究本研究首先对rmlT基因的生物信息学进行探究,并预测其蛋白结构和功能。rmlT编码由623个氨基酸构成的胞外蛋白RmlT,其三维结构与金黄色葡萄球菌WTAs糖基转移酶TarS相似。蛋白互作预测结果显示,RmlT与AZD9291使用方法鼠李糖基合成酶lmo1084、糖基转移酶lmo1090、lmo1744和 lmo2550,以及壁磷壁酸合成酶lmo1081、lmo1082 和 lmo1083存在蛋白间的相互作用关系,共同参与由鼠李糖基和GlcNAc修饰的Lm WTAs生物合成过程。其次,本研究利用同源重组技术成功构建Lm WTAs的鼠李糖基缺失突变株EGD-eΔrmlT及其回复株EGD-e ΔrmlT::pIMK2(rmlT),为分析WTAs的鼠李糖基化修饰介导Lm的相关功能提供生物材料。同时,通过玻板凝集实验测定Lm的菌体抗原特性,结果表明EGD-e ΔrmlT与Lm OI型诊断血清不发生凝集反应。此外,本研究通过UPLC-MS/MS分析并鉴定了 Lm WTAs的结构组成及糖基化修饰。结果显示,rmlT基因的缺失使Lm WTAs失去了鼠李糖基的修饰,证明rmlT基因编码Lm EGD-e WTAs的鼠李糖基转移酶。为了研究WTAs的鼠李糖基化修饰对Lm生长繁殖的影响,本研究测定了 野生株 EGD-e、rmlT 突变株 EGD-e ΔrmlT 和 EGD-e ΔrmlT::pIMK2(rmlT)在BHI培养基中的生长曲线,野生株与突变株在BHI培养基中的生长曲线无显著性差异,表明WTAs的鼠李糖基化修饰对Lm的生长未造成显著影响。2.鼠李糖基化修饰壁磷壁酸的促炎免疫应答特性研究本研究以巨噬细胞RAW264.7和小鼠原代巨噬细胞BMDMs为体外感染模型,以C57BL/6N小鼠为体内感染模型,探究了鼠李糖基修饰WTAs介导Lm诱导宿主炎性应答、脏器定殖和毒力的特性。在体外感染模型中,首先利用肠上皮细胞Caco-2、巨噬细胞RAW264.7和BMDMs测定了 Lm的黏附侵袭能力。结果显示,rmlT缺失株对Caco-2细胞系的侵袭能力显著降低,对BMDMs细胞系的黏附及侵袭能力显著下降。随后,探究了 Lm WTAs鼠李糖基化修饰的免疫学特性。结果表明,与缺失株相比,含有鼠李糖基修饰的Lm野生型WTAs能介导细菌显著上调巨噬细胞RAW264.7和BMDMs中IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎细胞因子的转录表达,并下调抑炎细胞因子IL-10的转录表达。同时,鼠李糖基修饰的WTAs及野生型Lm感染BMDMs细胞后,显著上调了 IL-6和TNF-α在细胞上清中的分泌表达水平。此外,本研究对NF-κB信号通路的活化进行了检测,结果表明WTAs的鼠李糖基化修饰促进NF-κB信号通路的激活。利用Western blotting检测p65和IκBα的磷酸化水平,结果显示WTAs的鼠李糖基化修饰增强了 NF-κB信号通路关键蛋白p65和IκBα的磷酸化水平。在体内感染模型中,首先测定了 WTAs刺激小鼠后的体重变化和体内组织的炎性细胞因子转录水平。结果表明,WTAs的鼠李糖基化修饰能够显著上调促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α在体内脏器的表达。其次,测定了 EGD-e、EGD-e ΔrmlT和 EGD-eΔrmlT::pIMK2(rmlT)感染小鼠后,细菌定殖能力、脏器炎性细胞因子转录水平和组织病理学的变化。结果显示,含有鼠李糖基修饰WTAs的EGD-e野生株和EGD-eΔrmlT::pIMK2(rmlT)回复株,在肝脏及脾脏中的载菌量显著高于失去鼠李糖基修饰WTAs的EGD-e ΔrmlT缺失株。表明WTAs的鼠李糖基化修购买PD-0332991饰能够促进Lm的定殖能力,有助于Lm在体内的存活。随后通过荧光定量PCR检测小鼠肝脏及脾脏的炎性细胞因子转录水平。结果显示,含有鼠李糖基修饰的WTAs介导Lm上调体内促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达。组织病理学分析表明,WTAs的鼠李糖基化修饰提高了小鼠肝脏及脾脏的炎性细胞浸润程度和坏死水平,促进组织炎性反应的发生。综上所述,鼠李糖基化修饰的WTAs是血清型1/2a Lm菌体抗原的重要决定因素,增强了 Lm对宿主细胞的黏附侵袭能力,有利于Lm在宿主体内的定殖。本研究初步揭示了鼠李糖基化修饰的WTAs促进宿主免疫应答的分子机制,表明WTAs的鼠李糖基化修饰能够激活NF-κB信号通路,并上调其下游促炎细胞因子的转录表达和分泌水平,对李斯特菌病的预防和治疗具有重要意义。