冠状病毒(Coronavirus)是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒,在自然界中广泛存在,也是已知RNA病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒分为α、β、γ及δ四类,严重急性呼吸道冠状病毒2型(SARS-Co V-2)属于β型冠状病毒。SARSCo V-2有很强的传染性和致病性,同时SARS-Co V-2具备很强的变异能力,在大流行的三年时间内变异产生了包括Alpha,Beta,Gamma,Delta,Omicron等变异株。冠状病毒的病毒粒子外包裹着脂双层膜,膜表面有包括刺突蛋白(S)在内的多种糖蛋白。S蛋白介导病毒侵入靶细胞,其中S1亚基负责识别和结合宿主细胞血管紧张素转换酶2(ACE2)受体,S2亚基负责病毒与宿主细胞的膜融合。S1亚基中通过受体结合域(RBD)与ACE2结合后,S2亚基的融合肽(FP)插入细胞膜,HR2与HR1结合形成六聚体的结构,拉动HR1 N端的细胞膜和HR2 C端的病毒膜接触并发生融合。与S1亚基相比,不同冠状病毒的S2亚基具有更高的保守性,对于S2亚基的研究可以为冠状病毒预防、诊断和治疗提供新的思路。而高纯度和高活性的S2亚基的获取,对研究S2亚基的结构与功能、筛选靶向SSCH727965化学结构2亚基的单克隆抗体、设计以S2亚基为靶点的表位疫苗,具有重要的意义。本研究利用杆状病毒表达系统,对不同来源的冠状病毒S2亚基进行了表达、分泌及纯化研究,主要内容及结果如下:(1)选取了8种与SARS-Co V-2相关的冠状病毒(Ra TG13、WIV1、GX-P5L、GD18、Civet SZ3、Civet 007、SARS-Co V、SARS-Co V-2),对其S蛋白基因进行了生物信息学预测分析,确定了S2亚基的主要抗原区。将这些S2亚基的基因编码序列克隆到带有不同信号肽序列和检测纯化标签的表达载体上。(2)利用带有GP64sp与His Tag的pQB3载体对对其中4种冠状病毒S2蛋白进行表达和分泌检测,发现4种S2蛋白都有较好的表达分泌效果。与Sf9细胞相比,High Five细胞的分泌效果更好。利用Ni-Agarose Resin纯化系统对带有His Tag的S2蛋白进行纯化,发现蛋白的挂柱率很低。(3)利用带有Fib Hsp、m Fc Tag的p Tri Ex载体对上述4种冠状病毒S2蛋白进行表达,S2蛋白的表达量有所提高,但WIV1毒株的S2-Fc融合蛋白无分泌。利用Protein A Agarose纯化系统对S2-Fc融合蛋白进行纯化,在纯化的蛋白中出现了蛋白断裂的现象,推测这种断裂可能与细胞Nirogacestat的培养条件及洗脱液p H值过低都有关。(4)在pQB4载体的基础上插入Strep Tag构建了pQB4-SH重组载体。利用该载体表达8种冠状病毒S2蛋白,S2蛋白获得了良好的表达及分泌。利用Strep-Tactin XT4Flow纯化系统对带有Strep Tag的S2蛋白进行纯化,纯化效率显著提高。(5)在蝙蝠源的冠状病毒WIV1毒株的S2蛋白研究中,获得了第297位Arg突变为Gln、410位Val突变为Ile的突变体。蛋白表达结果发现,两个氨基酸突变并不影响其蛋白的表达量。但在蛋白的纯化方面,与野生型相比,突变型的蛋白纯化效率有明显提高。结构预测分析表明,突变导致蛋白N端尾部的Strep Tag暴露在蛋白的折叠区外,可以与纯化柱更好地结合。(6)BCA蛋白定量结果显示,Ra TG13毒株与WIV1毒株S2蛋白的纯蛋白产量最高,接近4mg/L;Civet 007毒株S2蛋白的纯蛋白产量最低,但也超过了2mg/L。(7)利用临床获得的人血清样品进行抗原活性检测。结果显示,接种SARS-Co V-2疫苗加强针前和接种加强针后的血清,多数可以与本研究获得的8种冠状病毒S2抗原产生阳性结果,且与接种加强针后的血清反应更强。该结果表明,本论文获得的冠状病毒S2亚biologic drugs基具有良好的抗原活性,而且8种S2蛋白具有一些共同的抗原表位,与SARS-Co V-2的抗血清具有交叉反应性。综上所述,本论文成功构建了可大量表达、分泌并纯化多种冠状病毒S2亚基的表达纯化体系。该表达体系的建立可以为后续冠状病毒S2蛋白的结构与功能研究、靶向S2亚基的单克隆抗体筛选、以S2亚基为靶点的表位疫苗设计等研究奠定基础。