木聚糖是地球上含量第二丰富的天然可再生多糖资源,它是一种复杂的杂PR-171溶解度多糖,由不同的单糖和有机酸在糖苷和酯键的作用下连接在一起,通过内切-β-1,4-木聚糖酶裂解β-1,4-糖苷键可以将木聚糖水解。木聚糖酶在自然界中广泛存在,如软体动物、昆虫和微生物中,微生物来源的木聚糖酶具有良好的底物特异性和生化特性,在工业和生物技术等领域应用广泛。虽然目前的研究报道中已经有大量的天然木聚糖酶被研究和克隆表达,但是大多数的天然木聚糖酶需要温和的环境条件才能发挥作用,而在一些高温高碱的极端生产条件下,天然木聚糖酶通常无法发挥有效的催化活性。本研究对来自Cellulomonas flavigena的木聚糖酶Xyn B进行序列和结构分析,利用基因工程的手段,通过柔性连接肽将在xyn B基因与一段表达冰核蛋白的inp基因连接,获得inp-Xyn B基因,将xyn B基因和inp-Xyn B基因分别插入p ET-28a(+)质粒的Nco I和Xho I酶切位点之间,成功构建了两株工程菌株,Escherichia coli BL21(DE3)-p ET-28a(+)-inp-Xyn B和Escherichia coli BL21(DE3)-p ET-28a(+)-xyn B。木聚糖酶Xyn B、Inp-Xyn B的最适p H为7.0,在p H 4.0-9.0的条件下,保留了60%以上的最大活性;最适温度为55℃,在60、70℃条件下,半小时以内酶活保持在50%以上,Ca~(2+)、Mn~(2+)、Fe~(2+)和Co~(2+)的存在能使酶活力提高,而Zn~(2+)、Ni~(2+)和Cu~(2+)则会使酶活力降低。该结果表明,游离表达和冰核蛋白表面展示后的Xyn B最适温度、最适p H等酶学特性较为相似,为后续木聚糖酶改造和突变子的筛选奠定了基础。为了提高木聚糖酶Xyn B的耐热性,通过序列对比和三维结构分析,采用N端片段替换的方式,将与Xyn B序列同源性达到64.9%的耐热木聚糖酶Syxyn11P的N端片段的前105、126、141和153个碱基片段扩增,将Xyn B的N端的前96、117、132和144个碱基通过反向PCR去除,通过无缝克隆拼接得到重组质粒,成功构建了四株工程菌株,通过IPTG诱导获得了四种改造木聚糖酶ECXyn1、ECXyn2、ECXyn3和ECXyn4。四种重组木聚糖酶的最适温度分别为60、60、65和85℃,其中ECXyn4的最适温度比Xyn B提高了30℃,Tm值比Xyn B高34.5℃,在p H 6.0-10.0的条件下能够保持50%以上的酶活力,比酶活提高至12151.18 U/mg,在金属离子浓度为1 mmol/L的反应体系中处理30 min,酶活力仍保持在90%以上。为了进一步的提高重组酶ECXyn4的热稳定性,选取了ECxMEK抑制剂yn4片段替换接缝处左右各60个碱基的区域进行随机突变,通过易错PCR的方式建立突变文库,使用15μL Star Mut Enhancer建立了最佳突变体Toxicant-associated steatohepatitis系,该体系重组子的总突变个数约达到整体个数的77.8%,碱基突变率约为2.59%,突变率适宜。通过流式细胞仪分选出单细胞,打入96深孔板中培养,诱导产酶,使用木聚糖酶特异性荧光底物检测活性,建立了木聚糖酶随机突变和筛选方法。本研究使用合理的设计策略结合分子生物学手段提高了木聚糖酶Xyn B的嗜热性和热稳定性,使得木聚糖酶在一些高温高碱的极端生产条件也能够发挥有效的催化活性,为扩大木聚糖酶的应用范围提供了研究基础。