假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)外膜囊泡(out membrane vesicle,OMV)作为疫苗递送系统构建的新型囊泡疫苗可以很好地预防鼠疫菌(Pestis)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的感染。然而OMV仍具有一定的毒性,研究发现脂多糖修饰可以降低OMV的毒性,然而作用机制尚未清晰。本研究以pRE112质粒为载体利用同源重组来构建YP1(?LpxA),YP2(?LpxL)基因缺失突变株,并通过特异性引物对突变体菌株YP1,YP2进行鉴定selleck化学。透射电镜观察菌体的形态发现YP1形状发生了改变,变为了圆球形,YP2形状没有改变但是可以观察到鞭毛。提取YP1,YP2菌株LPS及LipidA进行测定,发现LPS及LipidA分布和含量都发生了改变,表明基因缺失对LPS及LipidA产生了影响。通过电转化法将pNP214-PcrV转入突变体菌株得到重组菌株YP0(pNP214-PcrV),YP1(pNP214-PcrV)和YP2(pNP214-PcrV),并通过特异性引物进行了鉴定。采用超速离心法120 000×g,2 h离心,分离纯化得到重组OMV(rOMVyp0P,rOMVyp1P和rOMVyp2P),计算得到产率分别为7328.3±141μg/L,6975.2±112μg/L,5293.3±123μg/L。Western blot对目的蛋白进行鉴定,PcrV成功表达。通过透射电镜对重组OMV进行扫描观察,大小约为100-200 nm,通过纳米颗粒跟踪分析仪对重组OMV粒径分布及数量进行测定,rOMVyp0P的粒径大小为118.9±1.5 nm,rOMVyp1P的粒径大小为138.8±1.3 nm,rOMVyp2P的粒径大小为94.1±2.0 nm。测定重组OMV的蛋白组成并对蛋白的亚细胞定位进行预测,结果表明rOMVyp1P中蛋白分布影响较大,大多数蛋白分布在细胞质中。提取重组OMV的LPS进行测定,发现LPS分布及含量也发生了改变。采用5μg蛋白,40μg重组OMV免疫小鼠,记录小鼠体重的变化,免疫后发现野生株组小鼠体重明显下降,4 d后恢复正常,同时重组rOMVyp1P和rOMVyp2P组毒性细胞因子IL-6的水平是要低于野生株组,表明基因缺失会降低OMV的毒力。通过ELISA法对血清抗体(Ig A、Ig M、IgG、IgG1、IgG2a)进行测定,同时对血清中细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL17A)进行测定。免疫42d后通过铜绿假单胞菌PAO1菌株进行皮下攻毒以及鼻腔攻毒,对其免疫保护进行评价。抗体水平显示,无论是PcrV还是Opr F/I重组OMV组IgG2a/IgG1比值都在1左右,说明其诱导Th1/Th2平衡的体液反应,rOMVyp1P,rOMVyp2P以及rOMVyp2F/I都诱导较高的Ig M,Ig A抗体水平。皮下感染结果显示rOMVyp1P,rOMVyp2P以及rOMVyp2F/I组都产生了100%的保护率,鼻腔感染结果显示对不同的抗原产生的保护存在了差异rOMVyp0P和rOMVyp2P产生了20%的保护率,rOMVyp1P产生了10%的保护,而rOMVyp2F/I组存在明显差异存活率为0,小鼠全部死亡。综上所述,本研究通过敲除Y.pAIDS-related opportunistic infectionsseudotuberculosis YP0脂多糖类脂A合成相关基因(LpxA,LpxL),研究发现LpxA,LpxL基因缺失会引起脂多糖的结构改变从而降低OMV的毒性,获悉更多分离获得重组OMV,并对其生物学特性进行分析,发现基因缺失对重组OMV的体液免疫无显著差异,然而作用不同抗原引起的免疫保护存在明显差异。