海棠是重要的园林树种,其花色叶色丰富多变,具有极高的观赏性。低氮条件下海棠叶片可变红,影响其观赏价值与经济价值。为揭示低氮条件下海棠花叶片花青苷合成调控机制,本研究以海棠花(Malus spectabilis)叶片作为试验材料,对低氮条件下海棠花离体叶片进行表型观察与色素含量测定。结合全转录组测序,筛选出花青苷合成相关差异表达的m RNA、lnc RNA和mi RNA,构建了竞争性内源RNA靶标模拟调控机制,而后通过一系列分子生物学技术进行了关键基因的互作关系验证与基因功能验证,深入探讨了低氮条件下海棠花青苷合成的调控机制。主要研究结果如下:1.通过体视显微镜观察发现低氮条件下海棠花离体叶片表皮细胞和维管束中有红色色素沉积。通过高效液相色谱仪测定发现,矢车菊素-3-O-半乳糖苷的含量在低氮条件下上升,表明矢车菊素-3-O-半乳糖苷积累是低氮条件下海棠花叶片由绿变红的主要原因。2.通过全转录组测序技术筛选了低氮条件下海棠花离体叶片中的差异表达基因,获得4,030个差异表达的m RNA(DEm RNA),GO及KEGGSI-IX体内实验剂量G分析结果显示花青苷生物合成相关通路的基因在表达水平上产生了较大变化。根据转录组数据推测Ms MYB62-like可能在低氮条件下花青素生物合成中起负调控作用。此外,筛选出91CP-456773浓度2个差异表达的lnc RNA(DElnc RNA),以及389个差异表达的mi RNA(DEmi RNA)。以差异表达基因为基础,构建了竞争性内源RNA(ce RNA)靶标模拟调控网络,该调控网络由81个DEmi RNA-DEm RNA和80个DEmi RNA-DElnc RNA关系对组成。经逐步分析后预测出在低氮条件下参与花青苷合成调控的e TM(内源靶标模拟物)-mi R858-MsMYB62-like模块。3.亚细胞定位结果表明MsMYB62-like特异性定位于细胞核,酵母转录激活活性试验结果表明其具有转录激活能力。酵母双杂交和双分子荧光互补结果表明Ms MYB62-like不与被广泛报道为花青苷合成通路关键调控因子的Msb HLH3互作。酵母单杂交结果表明Ms MYB62-like可以与Ms F3’H的启动子结合,但是不能与Ms CHS、Ms CHI、Ms DFR、Ms ANS、Ms UFGT的启动子结合。双荧光素酶试验进一步验证了Ms MYB62-like具备抑制Ms F3’H的启动子活性的能力。当Ms MYB62-like在苹果愈伤组织中稳定过表达、或者在苹果果皮和海棠花叶片中瞬时过表达时,结构基因Ms F3’H的表达量明显下调,花青苷含量显著降低。当Ms MYB62-like在苹果果皮进行瞬时基因沉默时,结构基因MsF3’H的表达量上调,花青苷含量显著升高。以上结果表明在低氮条件下Ms MYB62-like通过抑制Ms F3’H的启动子活性的方式负调控花青苷合成。4.通过双荧光素酶报告系统和GUS染色及酶活测定试验证实miR858可以通过碱基互补配对的方式切割Ms MYB62-like,抑制其表达。当mi R858在苹果愈伤组织中稳定过表达或者在苹果果皮和海棠花叶片中瞬时过表达时,Ms MYB62-like的表达量显著下降,而花青苷含量上升。说明mi R858可以通过靶向切割Ms MYB62-like,削弱其对花青苷合成通路的抑制作用,促进结构基因的表达,致使花青苷合成。5.通过双荧光素酶报告系统和GUS染色及酶活测定试验发现,当eTM858-1或e TM858-2与mi R858和Ms MYB62-like共表达时,Ms MYB62-like的表达水平上升,表明e TMHomogeneous mediator858-1和e TM858-2可以通过竞争性结合mi R858,削弱其对靶基因Ms MYB62-like的切割,起到促进Ms MYB62-like表达的作用。通过苹果果皮和海棠花叶片瞬时遗传转化试验证实,当e TM858-1或e TM858-2与mi R858和Ms MYB62-like共表达时,与对照组相比,mi R858表达量下降而Ms MYB62-like表达量上升,与此同时花青苷含量降低。这表明在e TM-mi R858-Ms MYB62-like模块中,e TM858-1和e TM858-2可以通过竞争性结合mi R858,干扰mi R858对其靶基因Ms MYB62-like的切割,使MsMYB62-like的表达水平上调,通过此途径抑制花青苷的生物合成。