【研究背景】脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,而胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是其中恶性程度最高、侵袭性最强的一种弥散性肿瘤,平均每年发病人数在25万以上。目前针对GBM患者主要的治疗方式仍是手术切除辅以放化疗的综合治疗,但预后极差,患者的中位生存期<14.6个月,5年生存率只有5.6%。由于人体存在血脑屏障,化疗和免疫治疗在胶质瘤患者中的应用受到限制,对于患者生存期的改善十分有限。放疗在GBM的治疗中占有极其重要的地位,手术切除GBM后放疗可以杀伤残留肿瘤细胞,降低复发率;对于难以手术切除的GBM,也可以通过放疗抑制胶质瘤生长。但GBM对放射容易产生抗性是预后不良的主要原因,因此,寻找新的靶点来为胶质瘤患者放疗增敏以改善治疗效果、延长生存期成为了迫在眉睫的工作。【研究目的】利用CRISPR/Cas9文库筛选GBM放疗抵抗相关基因,系统探索该靶点介导放疗抵抗的功能与机制,并以该靶点为基础,探索基因编辑技术在GBM治疗中的新策略。【研究方法】1.运用全基因组CRISPR文库感染GBM细胞,构建原位GBM模型进行体内筛选,文库测序分析GBM放疗抵抗靶点;2.构建放疗抵抗GBM细胞,RNA测序与文库结果取交集,通过数据分析和实验初步确定GSS是放疗抵抗关键基因;3.构建稳定敲除GSS细胞株和放疗抵抗PDX模型,通过体内外实验,如免疫荧光、Western Blot、CCK-8、平板克隆实验等确定GSS表达水平与放疗敏感性的联系;4.通过分析公共数据库资料和GBM组织芯片,探究GSS与胶质瘤的临床相关性;5.利用免疫荧光和RNA-seq实验分析GSS介导的放疗增敏激活了细胞铁死亡通路;6.数据库分析、流式细胞仪检测脂源性ROS、透射电镜图像、CCK-8实验等方法验证放射与GBM细胞铁死亡之间联系;7.通过免疫组化、WB、代谢组学分析等实验系统阐明GSS在胶质瘤放疗过程中发挥作用机制;8.将Cas9/sgGSS复合物装载入靶向胶质瘤的细胞外囊泡,并在原位胶质瘤模型中验证效果,探索其对放疗敏感性的影响。【研究结果】1.成功进行了体内全基因组CRISPR文库的筛选,数据分析得到放疗敏感基因;2.成功构建了放疗抵抗细胞株,RNA-seq与文库结果取交集得到目的靶点GSS;3.成功构建了稳定敲除GSS细胞株和放疗抵抗PDX模型,免疫荧光、WB等实验证明放疗抵抗模型中GSS蛋白高表达,CCK-8、细胞克隆形成实验等证明GSS敲除增强了放疗效果;4.数据库资料和组织芯片显示,GSS的高表达导致了不良预后;5.根据免疫荧光和RNA-seq结果得出,GSS介导的放疗增敏与DNA损伤修复无关,与细胞铁死亡通路相关;6.放射后,流式细胞仪检测显示脂源性ROS上升,透射电镜、CCK-8实验、数据库分析得出放射诱导GBM细胞铁死亡;7.放疗过程中,敲除GSS抑制了GSH合成,一方面降低了GPX4活性,导致脂质过氧化物累积;另一方面加剧了Fe~(2+)的积累,形DNA/RNA Synthesis抑制剂成了不稳定铁池,引起芬顿反应,产生过量的ROS,加剧铁死亡发生;8.构建Ang/TAT-sgGSS-EV,并在LN229原位模型和GSC原位模型中验证可以有效干扰GSS表达,与放射联合处理显著增强了放疗敏感性,证明在体基因编辑治疗策略成功。【结论】1.通过CRISPR/Cas9文库体内压力筛选出放疗联合致死基因集,联合放疗抵抗细胞株的转录组测序结果,发现了GSS在胶质瘤放疗抵抗过程中发挥了关键作用。2.通过在线数据库资料、组织芯片和临床样本系统证实GSS表达水平与胶质瘤患者分级分期及不良预后密切相关,级别越高的胶质瘤,GSS表达水平越高,预后越差;3.通过细胞学实验Elexacaftor molecular weight、分子生物学实验和数据库资料分析,GSS介导的放疗抵抗机制与铁死亡相关。GSS通过合成还原性谷胱甘肽增强GPX4活性,从而还原脂质过氧化物,减少了亚铁离子的积累,抑制芬顿反应,从而抑制铁死亡。4.在LN229原位胶质瘤模型和胶质瘤干细胞原位模型中,Ang/MSC necrobiologyTAT-sgGSS-EV具有较高的靶向效率和较强的基因编辑能力,能够实现对GSS的体内靶向干预,与放疗联用可显著抑制胶质瘤发展,具有潜在的临床应用前景。