[背 景]虫媒病毒是指一类在吸血节肢动物体内复制并通过吸血过程将病毒传播给宿主动物的病毒。人类、家禽、家畜以及野生动物被昆虫叮咬后被感染,出现发热、出血、脑炎等症状和疾病。虫媒病毒对全世界,尤其是发展中国家的人类和动物健康构成了极大的威胁,是一个主要的全球公共卫生问题。云南省位于中国的西南边界,与缅甸、老挝、越南毗邻,属热带和亚热带气候。由于其独特的地理位置和气候特征导致云南省不仅是境外输入虫媒病毒最多的省份,也是国内新发现虫媒病毒最多的省份之一。因此,在云南省西部边境开展系统的虫媒病毒调查,有助于为当地虫媒病毒的防控提供科学依据。[目 的]在云南省西部边境地区开展媒介昆虫(蚊虫和蠓虫)及其携带病毒调查,了解该地区传播媒介及携带病毒的种类和分布;对新分离病毒进行分子鉴定,明确新分离病毒的分类地位;在此基础上,对一株新分离西藏环状病毒进行全基因测序和序列分析,从全基因组水平上明确新分离代表毒株的分子特征和遗传进化关系。同时,在当地开展动物血清流行病学调查,了解新分离病毒在家养动物中的感染和流行情况,为该地区虫媒病毒传染病的防治提供科学依据。[方 法]1.2018年7月在云南省芒市、盈江、泸水、腾冲的采集蚊虫和蠓虫样本,采用形态学分类的方法对采集的媒介昆虫进行分类鉴定。2.将采集到媒介昆虫样本进行研磨,分别接种在BHK-21和C6/36细胞进行病毒分离。从阳性分离物上清中提取核酸,分别使用虫媒病毒特异性引物进行RT-PCR扩增,阳性产物送生工生物公司进行测序。使用Clustal X、DNAStar、Mega-X等生物软件进行序列分析。3.采用双链RNA病毒全长cDNA扩增技术(FLAC)对新分离TIBOV MS18C217-16株进行全基因组扩增,使用生物信息软件对其基因组结构与特征进行分析。同时观察不同血清型TIBOV MS 18C217-16株与DH13C120株在BHK-21、C6/36Biocomputational method、VERO、PK15、HELA、MDBK等细胞中的增殖情况,绘制增殖曲线,比较不同血清型两株TIBOV生物学特征差异。4.选取2018年以来在云南省4个地区采集的680份动物血清,采用微量中和实验的方法检测这些动物血清中新分离TIBOVMS18C217-16株中和抗体。同时采用微量中和试验比较动物血清中不同血清型TIBOV(MS18C217-16株和DH13C120株)中和抗体滴度。对新分离病毒MS18C217-16采用不同血清型TIBOV病毒株DH13C120、SZ18、JCC637-2制备的特异性免疫腹水进行免疫中和试验。[结 果]1.2018年在芒市、盈江、泸水、腾冲累计采集库蚊、按蚊、阿蚊、伊蚊4个属的8种蚊虫共计8581只。三带喙库蚊是芒市和盈江地区的优势蚊种,中华按蚊是泸水和腾冲地区的优势蚊种。采集蠓虫共计18296只,其中在芒市共采集到19种库蠓7396selleck化学只,条带库蠓为优势蠓,构成比为59.79%;在泸水共采集到15种库蠓4602只,荒川库蠓为优势蠓,构成比为48.11%。2.蚊虫分为170个批次,蠓虫分为203个批次进行病毒分离,获得112株阳性病毒分离物,49株分离自蚊虫,63株分离自蠓虫。蚊虫和蠓虫病毒分离的批阳性率分别为28.82%和31.03%。四个地区病毒分离的批阳性率依次为芒市(51.45%)、泸水(22.73%)、盈江(7.41%)、腾冲(5.61%)。3.经过分子生物学鉴定,112批阳性分离物分别隶属于8科9属的10种病毒,包括 33 株 YUOV、83 株 TIBOV,6 株 BAV,5 株 NDiV,1 株 AKAV,53 株 MAV,2 株 CxFV,4 株 CppDNV,1 株 CuTLV,1 株 ArIFV。4.TIBOV分离株MS18C217-16的PAGE显示该病毒是10节段的dsRNA病毒,片段迁移模式为3-3-3-1。病毒基因组有19247 nt核苷酸序列,编码6616个氨基酸,其T3和OC1蛋白和与7株TIBOV的氨基酸同源性分别在93.9%～97.7%,27.7%～58%,提示MS18C217-16株可能是一株新型TIBOV。病毒的生物学特征研究提示 MS18C217-16 和 DH13C120 都能在 BHK-21、VERO、PK15、HELA、MDBK和C6/36等6种细胞中增殖,其中能在BHK-21、VERO、PK15细胞中产生病毒噬斑。5.动物血清流行病学调查结果显示,在勐腊和芒市的牛血清、山羊血清和猪血清,景洪和江城的猪血清中都检测到了 MS18C217-16毒株的中和抗体。四个地区的抗体阳性率依次为勐腊(23.86%)、景洪(12.73%)、芒市(8.11%)、江城(7.41%)。三种动物血清的抗体阳性率依次为山羊血清(38.46%)、猪血清(12.86%)、牛血清(3.72%)。MS 18C217-16株与DH13C120株抗体滴度的比较提示,20份MS18C217-16株抗体阳性血清中有19份血确认细节清DH13C120株抗体也阳性,1份勐腊山羊血清(ML19)DH13C120株抗体阴性。相比MS18C217-16株,DH13C120株的抗体滴度在4份血清中表现出了 4倍升高,1份血清表现出2倍升高,4份血清表现出2倍降低,5份血清表现出4倍降低,有5份血清二者的抗体滴度相同。将 MS18C217-16 株制备的抗原片与 TIBOVDH13C120 株、SZ18 株、JCC637-2 株制备的特异性免疫腹水进行间接免疫荧光试验,三者都表现出阳性,抗体滴度分别为 1:80、1:40、1:40。[结论]本研究调查结果提示在云南西部边境地区存在多种蚊虫(8种)和蠓虫(29种)、蚊虫和蠓虫密度高。从这些媒介昆虫分离获得8个科9个属的10种病毒,病毒分离的批阳性率为30%,提示云南西部边境地区虫媒病毒种类多,媒介带毒率较高。对一株新分离TIBOV全基因组序列分析和血清交叉中和试验结果提示该株病毒可能为新血清型TIBOV。该病毒不仅能在猪、牛、猴、人、鼠等多种哺乳动物细胞中增殖,还能在云南省多个地区的牛羊猪等动物血清中检测到较高滴度中和抗体,提示该病毒能够感染人和多种哺乳动物,可能是多种动物潜在的病原体。