目的:口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔颌面部恶性肿瘤中最常见的病理类型,晚期常见颈部淋巴结转移和远处转移。由于OSCC侵袭转移的分子机制尚未明确,其临床预后较差。肿瘤相关巨噬细胞(Tumorassociated macrophages,TAMs)是肿瘤微环境中主要的免疫细胞。乳酸是有氧糖酵解的主要产物,介导OSCC细胞和巨噬细胞之间的交互作用。然而,OSCC细胞来源的乳酸通过对巨噬细胞进行调控进而影响侵袭转移的分子机制尚未阐明。本研究通过验证OSCC肿瘤微环境中乳酸对巨噬细胞极化状态和GPNMB表达的调控,进而探讨GPNMB促进OSCC细胞迁移和侵袭的分子机制。方法:1.收集人舌鳞状细胞癌CAL27细胞来源的肿瘤条件培养基(Tumorconditioned medium,TCM),用于体外诱导肿瘤相关巨噬细胞。2.分别采用TCM,外源性乳酸和单羧酸转运体抑制剂α-CHC干预THP-1来源的巨噬细胞,研究其极化状态和GPNMB的表达水平。3.CCK8法检测不同浓度乳酸和α-GSK1120212分子量CHC对THP-1来源的巨噬细胞活力的影响。4.RT-q PCR,Western blot和免疫荧光检测THP-1来源的巨噬细胞M1/M2型标记物和GPNMB的表达水平。5.ELISA检测巨噬细胞GPNMB的分泌水平。6.细胞划痕实验和Transwell实验验证重组GPNMB蛋白(rh GPNMB)对CAL27细胞迁移和侵袭能力的影响。7.Western blot检测rh GPNMB对CAL27细胞上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。8.生物信息学分析GPNMB潜在互作蛋白。9.免疫荧光检测GPNMB与CD44蛋白共定位关系。10.免疫共沉淀检测GPNMB与CD44蛋白结合关系。11.采用RNA干扰技术靶向沉默CAL27细胞CD44的基因表达。12.Western blot检测rh GPNMB对CAL27细胞PI3K/AKT/m TOR信号通路蛋白的磷酸化水平的影响。结果:1.CCK8细胞活力检测结果提示,不超过10 m M乳酸和4 m Mα-CHC为THP-1细胞的安全浓度。RT-q PCR结果显示,TCM中添加5-10 m M乳酸诱导的巨噬细胞M2型标记物CD206和ARG1的m RNA表达水平上调,M1型标记物i NOS的m RBlebbistatin molecular weightNA表达水平下调,并呈现浓度依赖效应(P<0.05),而M1型标记物CD86的m RNA表达水平在该时间点各分组无显著差异(P>0.05)。Western blot结果显示,10 m M乳酸促进ARG1的蛋白表达水平(P<0.05)。免疫荧光结果显示,TCM中添加10m M乳酸诱导的巨噬细胞CD206显示更高的荧光强度。2.RT-q PCR结果显示,与OSCC细胞系CAL27细胞相比,THP-1来源的巨噬细胞GPNMB的m RNA水平更高(P<0.05)。与普通培养基诱导的对照组相比,TCM诱导的巨噬细胞GPNMB的m RNA水平进一步上调(P<0.05),IL-4诱导的M2型巨噬细胞GPNMB的m RNA水平显著高表达(P<0.05)。TCM中添加10 m M乳酸促进巨噬细胞GPNMB的m RNA水平(P<0.05),而TCM中添加α-CHC抑制了巨噬细胞GPNMB的m RNA水平(P<0.05)。ELISA结果显示,乳酸促进巨噬细胞GPNMB的蛋白分泌水平,α-CHC抑制巨噬细胞GPNMB的蛋白分泌水平(P<0.05),Western blot和免疫荧光验证了乳酸促进巨噬细胞GPNMB蛋白的表达。3.划痕实验和Transwell实验证明,rh GPNMB能显著促进CAL27细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05);Western blot结果显示,rh GPNMB促进了CAL27细胞间充质标记物N-cadherin的表达而抑制了上皮标记物E-cadherin的蛋白水平(P<0.05)。4.STRING数据库筛选出GPNMB的潜在相互作用蛋白,其中CD44与细胞增殖、迁移和侵袭紧密相关。与Ha Ca T细胞相比,CAL27和SCC9细胞中CD44具有更高的m RNA表达水平(P<0.05)。TAMs-CM促进了CAL27细胞CD44的m RNA和蛋白水平(P<0.05)。免疫荧光显示GPNMB与CD44在细胞上共定位。免疫共沉淀验证GPNMB和CD44在细胞内结合。5.沉默CD44的表达显著抑制CAL27细胞的迁移和侵袭能力,同时减弱了rh GPNMB对CAL27细胞迁移和侵袭的影响(P<0.Fetal medicine05)。Western blot结果显示,抑制CD44受体后再加rh GPNMB干预,EMT相关蛋白无显著变化。6.rh GPNMB刺激对CAL27细胞PI3K、AKT和m TOR总蛋白表达量没有明显变化,而其磷酸化水平呈现时间依赖性变化(P<0.05);转染CD44-si RNA后rh GPNMB的刺激对AKT蛋白磷酸化水平变化无显著影响。结论:1.乳酸诱导巨噬细胞向M2型极化。2.乳酸促进巨噬细胞GPNMB的表达和分泌。3.GPNMB/CD44轴激活AKT信号通路,促进OSCC细胞迁移、侵袭和EMT。