研究背景多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)是一类常见的环境污染物,国际癌症研究机构已经确认其中一些化合物具有致癌作用。关于PAHs致癌性的干预与治疗一直备受重视。肿瘤治疗有多种措施,化疗是其中重要的手段。羟基脲(Hydroxyurea,HU)是一种常见的化疗药物被用于治疗乳腺癌等多种肿瘤,HU是核糖核苷酸还原酶抑制剂,可通过抑制DNA复制造成单断端的DNA双链断裂(one-end DNA double strand breaks,one-end DSBs),导致 DNA 复制损伤,达到杀伤肿瘤的作用。由于单一的药物治疗会引起肿瘤耐药性的发生,因而揭示药物耐受的机制以及发现能特异性干预致耐药靶点的制剂以增强药物杀伤肿瘤的作用,是该领域研究热点,这对PAHs致癌性干预研究也具有重要的意义。在应答HU诱发的DSBs中,机体会启动DNA损伤修复和细胞周期S期阻滞两种机制以修复损伤的DNA,认为这两种机制可能是导致肿瘤对HU耐受的主要原因。课题组前期研究证明高度磷酸化的复制蛋白A2(Hyperphospharylation of Replication Protein A 2,pRPA2)介导的重组酶 Rad51(Rad51)-同源重组(Homologous recombination,HR)通路能特异性地参与HU诱导的单断端的DSBs的修复。HU诱导的细胞周期S期阻滞则直接与检查点激酶-1(Checkpoint kinase-1,Chk1)的激活(Chk1磷酸化,pChk1)状态密切相关。已知pChk1可被ATR(毛细血管扩张性共济失调Rad3相关激酶)激活,导致细胞滞留在S期,以便损伤的DNA修复。由于去磷酸化是使检查点激酶失活的最直接的方法,有理由推测Chk1的去磷酸化过程也可能参与了 S期阻滞的调控,但是目前尚未见相关的报道。有研究提示磷酸酶2A(Phosphatase2A,PP2A)是调控蛋白去磷酸化的关键磷酸酶,PP2A的B调节亚基PPP2R2A缺陷使非小细胞肺癌细胞对Chk1抑制剂更敏感,本课题创新性地提出PPP2R2A寻找更多可能参与了 Chk1去磷酸化调控的科学假设,进一步推测Chk1磷酸化和去磷酸化调控机制都可能参与了 HU诱导的S期阻滞。发现能特异性靶向干预HU诱发的DNA损伤修复和S期阻滞两种机制的制剂,以解除肿瘤对HU耐受和增强肿瘤对其敏感性,是该领域研究中关键问题之一。丙戊酸(Valproic acid,VPA)作为Ⅰ类和Ⅲa类的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histonedeacetylase inhibitor,HDACi),是临床上用于治疗癫痫病的药物。课题组前期研究在细胞水平上证明VPA能增敏HU杀伤肿瘤的作用,但VPA增敏作用是否能通过靶向干预HU诱发的DNA损伤修复和S期阻滞细胞两种分子机制,目前尚不清楚。本课题组前期已经应用PAHs中具有代表性的环境致癌物二甲基苯并[a]蒽(7,12-dimethylbenz[a]anthracene,DMBA)成功建立了原发性乳腺癌动物模型以及正常乳腺上皮细胞恶性转化细胞模型,本研究拟应用已建立的这两种模型,围绕VPA增敏HU杀伤肿瘤的作用,开展以下研究:(1)VPA如何靶向抑制pRPA2-Rad51-HR修复通路以降低HU诱发的修复DNA损伤能力;(2)磷酸酶PPP2R2A是否能调控Chk1的去磷酸化并参与细胞周期S期阻滞的调控,以及VPA是否也能靶向激活PPP2R2A-Chk1信号轴以解除HU诱发的细胞周期的阻滞;(3)VPA对HU所致的正常组织细胞毒性作用的影响;(4)通过乳腺癌组织芯片和乳腺癌公共数据库,研究pRPA2、PPP2R2A和Chk1等关键蛋白分子可能的临床意义。第一章 丙戊酸增强羟基脲对苯并蒽诱导的乳腺肿瘤防治作用的影响研究目的首先应用本课题组前期建立的DMBA诱导的原发性乳腺癌动物模型和正常乳腺上皮细胞恶性转化细胞模型,研究VPA对HU防治乳腺肿瘤组织细胞的作用的影响。研究方法采用RNA-seq分析找出肿瘤细胞中差异明显的基因。在应答HU诱导的DNA复制损伤条件下,用克隆形成实验、苏木素和伊红(HE)染色、免疫组织化学染色、Western blotting、免疫荧光、彗星实验、流式细胞术和DNA Fiber实验来检测VPA对肿瘤组织细胞生长、DNA损伤、HR修复、细胞周期S期阻滞、DNA合成和细胞周期检查点激酶的影响。研究结果肿瘤细胞中参与细胞周期调控的基因如Chk1、细胞周期蛋白依赖激酶(Cyclin-dependentkinases,CDK1)等显著升高。在应答HU诱导的DNA复制损伤条件下,VPA进一步抑制肿瘤细胞的生长、促进肿瘤组织细胞坏死,VPA增加 DNA 损伤标志物 γH2AX 和 P53 结合蛋白 1(P53 binding-protein 1,53BP1)的表达、增加彗星拖尾长度,抑制HR修复蛋白pRPA2(S33)、pRPA2(S4/8)和Rad51的活性,VPA减少细胞周期S期阻滞和增加DNA合成速率,以及降低ATR、pChk1、WEE1和pCDK1-Y-15细胞周期检查点激酶的蛋白水平。第二章丙戊酸增强羟基脲对苯并蒽诱导的乳腺肿瘤防治作用的机制研究研究目的拟从HU诱发的DNA损伤修复和细胞周期S期阻滞两方面研究VPA增强HU杀伤肿瘤的机制。关于DNA损伤修复机制,探讨结构特异性内切酶MUS81对pRPA2的调控作用,以及VPA是否通过MUS81-pRPA2信号轴调控HR修复。关于细胞周期S期阻滞机制,通过探索PPP2R2A和Chk1蛋白之间的关系,建立PPP2R2A-Chk1调控细胞周期信号轴,以及VPA对该信号轴的影响。还研究pRPA2(S4/8)、PPP2R2A和pChk1-S317在乳腺癌患者肿瘤组织的表达水平并分析其与乳腺癌患者生存时间的关系,确定这些关键蛋白分子的临床意义。研究方法在应答HU诱导的DNA复制损伤条件下,用克隆形成实验、CCK8、RT-PCR、Western blotting、免疫荧光、彗星实验、siRNAs转染、CRISPR/Cas9基因敲除、流式细胞术和免疫组织化学染色实验研究VPA对HR修复蛋白的调控是否依赖于MUS81-pRPA2信号轴,VPA对细胞周期S期的调控是否依赖于PP2A(PPP2R2A)-Chk1信号轴,VPA是否通过抑制HDAC1/2是调控PPP2R2A。采用CO-IP、蛋白半衰期检测实验、Denaturing-IP、Western blotting、流式和CCK8实验检测PPP2R2A和Chk1蛋白之间的关系,以及PPP2R2AD197和N181对Chk1去磷酸化和VPA调控细胞周期的影响。使用人乳腺癌组织芯片和Kaplan-Meierplotter 数据库研究 pRPA2(S4/8)、PPP2R2A Lapatinib核磁和 pChk1-S317 的表达水平并分析其与乳腺癌患者生存时间的关系。研究结果在应答HU诱导的DNA复制损伤条件下,VPA通过pRPA2加剧DNA损伤、抑制肿瘤细胞HR修复和细胞存活;MUS81能够调控pRPA2-Rad51信号轴,且VPA通过下调MUS81-pRPA2信号轴抑制肿瘤细胞的HR修复;PPP2R2A-Chk1信号轴,且VPA通过该信号轴抑制肿瘤细胞的存活、减少细胞周期S期阻滞、降低检查点激酶的磷酸化水平。PPP2R2A和Chk1在同一个蛋白复合物上,PPP2R2A的缺失使Chk1蛋白更加稳定。PPP2R2A能够促进pChk1-S317和pChk1-S345的去磷酸化。PPP2R2A中D197和N181这两个氨基酸位点对Chk1磷酸化和VPA调控细胞周期的作用至关重要。VPA通过抑制HDAC1/2在转录后水平负调控PPP2R2A。pRPA2network medicine(S4/8)高表达的患者生存期较差。乳腺癌组织中PPP2R2A和pChk1-S317呈负相关,pChk1-S317高表达或PPP2R2A低表达的乳腺癌患者生存期较差。第三章 丙戊酸减少羟基脲对正常组织细胞毒性作用与其机制的研究研究目的探讨VPA减少HU对正常组织细胞毒性的作用及机制研究,为VPA的安全性提供理论和实验依据。研究方法在应答HU诱导的DNA复制损伤条件下,用克隆形成实验、CCK8、免疫荧光、彗星实验、HE染色、免疫组织化学染色、流式细胞术、DNA Fiber、RT-PCR、siRNAs转染和Western blotting等实验来检测VPA对正常组织细胞生长、DNA损伤、HR修复、细胞周期、DNA合成和细胞周期检查点激酶等的影响;PP2A(PPP2R2A)-Chk1信号轴以及PPP2R2AD197和N181氨基酸位点对VPA调控细胞周期的影响;VPA通过抑制HDAC1/2是如何调控PPP2R2A。研究结果对于正常组织细胞,在应答HU诱导的DNA复制损伤条件下,VPA能够减轻正常组织细胞的损伤,恢复大鼠的体重;VPA降低DNA损伤标志物γH2AX和53BP1的表达,减少细胞彗星拖尾长度;VPA进一步增加HR修复蛋白pRPA2(S4/8)和Rad51的表达;VPA进一步增加细胞周期S期阻滞,减少DNA合成速率,增加细胞周期检查点激酶的蛋白水平;VPA通过PPP2R2A-Chk1信号轴增加正常细胞在细胞周期S期的阻滞,以及PPP2R2A的D197和N181两个位点在VPA调控细胞周期中至关重要;VPA还通过抑制HDAC1/2在转录后水平正调控PPP2R2A。研究结论1.VPA通过抑制HR修复、减少细胞周期S期阻滞来增强HU杀伤苯并蒽诱导的乳腺肿瘤组织细胞,同时VPA通过促进HR修复、增加细胞周期S期阻滞来降低HU对正常组织细胞的毒性。2.VPA能靶向抑制MUS81-pRPA2-HR修复通路以降低肿瘤细胞中HU诱发的修复DNA损伤能力,并靶向激活PPP2R2A-Chk1信号轴以解除HU诱发的细胞周期S期阻滞,同时VPA通过干预PPP2R2A-Chk1信号轴增加HU诱发的正常细胞S期阻滞。3.VPA通过PPP2R2A D197和N181这两个氨基酸位点来解除HU诱发的肿瘤细胞S期阻滞、促进Chk1去磷酸化,同时VPA通过这两个位点增加HU诱发的正常细胞S期阻滞、减少Chk1去磷酸化。4.VPA通过抑制HDAC1/2在转录后水平调控PPP2R2A。5.pRPA2高表达、PPP2R2A低表达和pChk1-S317高表达与乳腺癌患者预后不良有关。