目的肺炎克雷伯菌可引起广泛感染,是导致医院获得性肺炎和社区获得性肺炎的一种重要病原菌。高毒力肺炎克雷伯菌感染通常造成高死亡率,该病原菌的出现对临床细菌感染的有效治疗提出了一个严峻挑战。本研究旨在探讨不同毒力肺炎克雷伯菌感染对宿主细胞和先天免疫系统的影响,重点关注宿主-fee-for-service medicine病原体相互作用背景下的细胞焦亡、凋亡和自噬,以期更好地了解肺炎克雷伯菌的致病机制。方法黏液拉丝实验检测细菌高黏液表型,PCR实验扩增荚膜血清型K2基因和毒力基因iro B、rmp A以鉴定经典肺炎克雷伯菌(c Kp)与高毒力肺炎克雷伯菌(hv Kp),然后用这两种菌株分别感染RAW264.7巨噬细胞和C57BL/6小鼠进行体外和体内研究。用FITC标记肺炎克雷伯菌后感染巨噬细胞,通过流式细胞术检测巨噬细胞的吞噬功能;Calcein-AM/PI双染色实验和乳酸脱氢酶(LDH)释放试验测定感染后的巨噬细胞活力;采用实时荧光定量PCR、ELISA实验检测巨噬细胞中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达量以及DCFH-DA荧光探针检测巨噬细胞中活性氧(ROS)的生成情况来评估炎症反应;利用免疫印记实验(Western blot)检测Captisol焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1 p20和GSDMD-N的表达水平,Annexin V-FITC/PI实验检测巨噬细胞凋亡率,免疫荧光实验测定自噬蛋白LC3的表达量等评估肺炎克雷伯菌感染后巨噬细胞焦亡、凋亡和自噬的发生情况。此外,进一步采用气管插管滴注肺炎克雷伯菌悬液建立小鼠肺炎模型,进行体内验证实验。每隔24小时记录一次小鼠生存率,连续记录七天,绘制小鼠生存曲线;H&E染色和实时荧光定量PCR实验检测肺组织中IL-1β和TNF-α的表达量以评估小鼠肺组织病理变化;实时荧光定量PCR和免疫组化等方法检测相关标志物的m RNA和蛋白表达水平以验证细胞焦亡、凋亡和自噬的体内发生情况。结果1.cKp组的巨噬细胞平均吞噬率为28.2%,hvKp组的平均吞噬率只有12.6%,差异有统计学意义(P<0.05)。2.Calcein-AM/PI细胞染色实验显示肺炎克雷伯菌感染后巨噬细胞死亡数量增多,且hv Kp组细胞死亡数量明显高于c Kp组;LDH释放实验表明肺炎克雷伯菌感染促进巨噬细胞释放LDH,且hv KP组巨噬细胞上清液中LDH活性更高(P<0.05),hv Kp感染对巨噬细胞的细胞毒性作用更明显。3.生存分析显示hvKp组的小鼠在感染后四天内全部死亡,而c Kp组有75%的小鼠在整个观察期间内仍然存活,hv Kp组小鼠死亡率显著高于c Kp组(P<0.05)。4.H&E染色显示hv Kp组小鼠肺组织炎症细胞广泛浸润,肺泡壁明显增厚和破裂,而c Kp组小鼠肺组织炎症细胞少量浸润,肺泡壁轻度增厚。hv Kp组小鼠肺组织病变程度较c Kp组小鼠更严重。5.促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和炎症介质ROS在肺炎克雷伯菌感染后表达量增多,hvKp组表达量明显高于c Kp组(P<0.05)。6.hv Kp组焦亡标志物NLRP3、ASC、GSDMD和Caspase-1表达量明显高于c Kp组(P<0.05)。7.肺炎克雷伯菌感染促进细胞凋亡,凋亡蛋白Caselleck激酶抑制剂spase-3在感染后表达量升高,且hv Kp组较c Kp组表达量更高(P<0.05)。8.c Kp组自噬标志物LC3、Beclin-1表达量较hv Kp组明显增多(P<0.05)。结论1.与cKp菌株相比,hvKp菌株能够抵抗巨噬细胞的吞噬作用。2.hv Kp菌株较c Kp菌株可引起更严重的细胞损伤和肺组织损伤。3.肺炎克雷伯菌感染可诱导细胞焦亡,hv Kp菌株较c Kp菌株诱导的焦亡程度更强烈。4.肺炎克雷伯菌感染促进细胞凋亡,hv Kp菌株的促凋亡作用较c Kp菌株更明显。5.c Kp菌株可明显诱导细胞自噬,而hv Kp菌株在一定程度上抑制细胞自噬。6.抑制自噬可能是hvKp菌株高致病性的部分原因。