目的:缺血性脑卒中给社会以及家庭带来严重的损失和沉重的经济负担,成为全世界低收入和中等收入国家的重大公共卫生负担和其所面临的主要健康卫生问题。其发病率的升高与人口老龄化、环境污染暴露等多种因素有关,其中,已经逐渐开始有更多对环境污染与缺血性脑卒中联系的探索。由缺血性脑卒中引起的组织损伤虽是致死原因之一,但缺血后再灌注引起的过量氧自由基生成是其组织损伤的重要因素。脑缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)损伤在全世界也是一种具有高死亡率和致残性的破坏性损伤。目前I/R损伤的发病机制研究主要集中在氧化应激和伴有小胶质细胞激活的神经炎症。因此,进一步阐明脑I/R的炎症反应致神经损伤的分子机制可以更好地了解其在神经功能保护中的作用。许多证据表明被称为炎症小体的多蛋白复合物组激活可显著加重缺血再灌注损伤的程度,NLRP3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor(NLR)pyrin domain containing 3)是其中研究最多的炎症小体。NLRP3炎症小体介导的无菌性炎症反应在缺血再灌注后组织损伤和神经细胞中起重要作用。一般在中枢神经系统的小胶质细胞会处于静息及休眠状态,一旦中枢神经系统遭到缺血乏C59使用方法氧等外界刺激,其可被迅速活化,同时分泌各种炎性细胞因子,如果小胶质细胞持续激活,将最终引起神经元损伤,加剧疾病的病理过程。而随着研究的深入,NLRP3炎症小体介导的新型细胞死亡形式—细胞焦亡,可能在神经功能损害和炎症诱导神经元死亡中起着至关重要的作用。作为一种神经保护剂,丁苯酞(3-n-butylphthalide,NBP)最近被报道具有抗氧化和抗炎作用,其在药理机制上具有复杂多靶点特性。本研究以C57BL/6J雄性小鼠为研究对象,制备小鼠大脑中动脉闭塞/再灌注(Middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)动物模型,以NLRP3炎症小体介导的神经炎症为立足点,通过分析炎症小体介导的小胶质细胞焦亡与脑损伤的关系,揭示丁苯酞减轻I/R损伤诱导NLRP3炎症小体介导的小胶质细胞焦亡致神经炎症的具体分子机制,为防治脑缺血再灌注损伤机制的研究提供试验依据。研究方法:60只健康雄性C57BL/6J小鼠(8-12周;体重25-30 g),按体重进行随机分组,每组10只,分组情况如下:对照组,60 mg/kg NBP对照组,假手术组,MCAO手术组,MCAO+溶剂组,MCAO+60 mg/kg NBP预处理组。对照组在整个实验期间不给予任何治疗;假手术组除了不进行1小时短暂性大脑中动脉闭塞手术外,其余操作与MCAO手术组小鼠相同;60 mg/kg NBP对照组再灌注前7天后7天连续给予NBP经口灌胃;MCAO手术组进行短暂性大脑中动脉闭塞手术1小时;MCAO+60 mg/kg NBP预处理组和MCAO+溶剂组再灌注术前7天经口灌胃NBP和等量溶剂(植物油),术后再灌注7天后再给予同样的溶液,连续14天之后进行相关指标检测。通过线栓法建立小鼠MCAO/R模型;采用激光多普勒血流仪监测小鼠脑血流变化,验证模型是否成功;采用神经功能评分、爪抓力试验、双足平衡试验、转棒试验、旷场试验及步态分析检测小鼠行为学改变;采用脑组织含水量、TTC染色、Fluoro Jade-C染色、TUNEL结合Neu N染色检测脑组织损伤情况;采用伊文思蓝染色检测血脑屏障渗透性;采用相关试剂盒检测脑组织中MDA、GSH等;利用流式细胞术检测脑缺血再灌注损伤诱导的细胞ROS;采用ELISA法检测组织匀浆液中的IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6;采用免疫荧光技术检测Ig G与Laminin的共定位、Iba1与NLRP3的共定位、Iba1与CD68的共定位、Iba1与GSDMD的共定位;采用免疫印迹技术半定量分析Trx、TXNIP、炎症相关因子(NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1)和NF-κB蛋白(p-IKKβ、IKKβ、p65)、焦亡相关蛋白(GSDMD-FL、GSDMD-N)蛋白表达。结果:小鼠MCAO/R损伤模型会导致小鼠神经行为异常。再灌注损伤后进行自主神经功能评Biomass distribution分,与假手术组相比,MCAO组小鼠神经功能评分降低。步态分析实验中MCAO组小鼠更易发生偏瘫步态及步态稳定性下降,旷场实验显示其平均www.selleck.cn/products/ly2157299速度和中心区域停留时间与假手术组相比都明显下降,转棒试验、双足平衡试验以及爪抓力试验中MCAO组小鼠运动能力较假手术组均表现下降,而且,TTC结果证实患侧出现脑梗死并伴有脑水肿,这些结果提示小鼠MCAO/R模型建立成功。与假手术组相比,MCAO手术组的细胞ROS形成显著增多,MDA水平与GSH/GSSG比例均显著增加,氧化损伤程度加重。与假手术组相比,MCAO组小鼠小胶质细胞活化(CD68)数显著增强,炎症因子释放增多。值得注意的是,Iba1和细胞焦亡蛋白GSDMD的荧光共定位分析显示梗死周围区域小胶质细胞焦亡比例显著增加。NBP预处理后可以减轻氧化损伤和神经炎症,对小胶质活化和焦亡也有抑制作用。结论:丁苯酞可以缓解小鼠脑缺血再灌注诱导的小胶质细胞NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡,改善再灌注后的神经损伤。