烷基糖苷作为新一代非离子、无毒、低刺激性和可生物降解的表面活性剂,具有广泛的用途。烷基糖苷可通过化学法和酶法合成。其中,化学法合成须在极端的条件下进行,并且需要保护和去保护过程,使用有毒的催化剂,反应的产物是烷基多糖苷的复杂混合物。酶法合成能克服化学合成的缺点,获得结构明确的烷基糖苷。糖苷酶易于生产,经济实惠,兼具底物特异性和高立体选择性,是合成烷基糖苷优异的候选酶源。来源于嗜热菌Thermotoga naphthophila RUK 10的β-半乳糖苷酶Tn1577可在75℃以上的高温下催化烷基糖苷的合成,且在有机溶剂中具有较好的稳定性。但是,由于糖苷酶同时具有水解和转糖基活性,导致转糖基化反应的产率降低,限制了糖苷酶在转糖基化反应中的应用。为此,本文通过对Tn1577进行分子改造,期望提高Tn1577的转糖基/水解比,从而提高烷基半乳糖苷的产率,并拓宽酶的底物特异性。通过酶与底物的分子对接、序列比对,以提高烷基糖苷产率为目标设计了9个定点突变体,R012V、https://www.selleck.cn/products/r-gne-140.htmlR102W、W183F、W183G、H271S、E314I、R353Q、E362G和E362D。利用全质粒PCR进行定点突变构建了突变体VX-765分子量蛋白表达菌株。经热处理、Ni-NTA亲和层析得到纯化酶,对突变体基本酶学性质进行表征并用于合成烷基糖苷。结果显示,H271S和R353Q水解o-NPG的活力是野生酶2.0和1.3倍,H271S和R102V对乳糖水解活力有所提高,其余突变体水解乳糖活力均低于野生酶。大多数突变体的最适温度与最适p H未发生明显变化。H271S合成丁基、己基半乳糖苷和辛基半乳糖苷的活力分别为野生酶的1.6倍、1.8倍和2.7倍。R102W和R353Q合成辛基半乳糖苷的产量为野生酶1.7倍和1.4倍,其转糖基/水解比为野生酶的2.3倍和3.1倍。通过定点突变,获得immune exhaustion了转糖基活力提高及对长链脂肪醇活力提高的单点突变体。W183F和R353Q合成的己基半乳糖苷的产率与野生酶持平,但其水解乳糖的活力只有野生酶的12.8%和45.7%,可减少对原料乳糖的水解,持续合成烷基糖苷,降低生产成本。GH42家族糖苷水解酶已解析11个三维结构,但都未能揭示结构域C的功能,本文设计了删除结构域C的截短突变体V594,经酶学性质表征,对结构域C的功能进行初步探究。结果显示,V594水解o-NPG和乳糖的最适温度和p H没有变化,但水解o-NPG的活力比野生酶提高了近1倍,对乳糖的水解活力损失了约20%。DSC分析和稳定性实验表明,V594的热稳定性和p H稳定性明显降低,表明结构域C对酶的水解活力影响较小,对维持酶的稳定性具有重要作用。综上所述,我们成功获得了转糖基/水解比升高的定点突变体,并且提高了合成烷基糖苷的产率,拓宽了酶对长链脂肪醇的活力,对烷基糖苷的生物合成具有重要价值。探索发现结构域C可能与酶的稳定性相关,也为GH42家族β-半乳糖苷酶的结构-功能关系研究提供依据,为其未来改造提供新思路。