芋螺毒素(Conotoxins,CTXs)是芋螺分泌的混合型多肽毒素,作用于多种离子通道或神经递质受体,引起麻木、抽搐、呕吐、呼吸衰竭等中毒症状。CTXs种类繁多,其中α-芋螺毒素MI(CTX-MI)和α-芋螺毒素GI(CTX-GI)等剧毒成分对人类有致命威胁;部分CTXs因其特异的识别作用,可作为探针用于神经生物学研究;此外,以ω-CTXs为代表的CTXs具有镇痛、神经保护、运动调节等药物活性,被誉为“海洋药物宝库”。但是,已鉴定的CTXs仅占预估总量的1%左右,作用机制和药理活性鲜有报道,定量检测仅依赖质谱技术,最重要的是缺少剧毒种类的靶向解毒药剂,这严重威胁了水下作业人员的生命健康,且阻碍CTXs相关研究及应用的推进。上述科学问题难以攻破的重要原因之一是缺乏针对CTXs的特异性分子识别元件。抗体虽然是最常用、最有效的识别元件,但CTXs属于半抗原,无法直接通过免疫动物获得单克隆抗体,且重组抗体的亲和性难以保证,因此需要筛选新型元件用于CTXs的识别、富集和活性阻滞。核酸适配体对多类靶标尤其是小分子化合物表现出特异的高亲和力,在分子痕检、疾病诊断、药物开发等领域得到广泛应用。因此,适配体有望作为特异性分子识别元件,推进CTXs相关研究的发展。本文以毒性最强、分布最广的CTX-MI和CTX-GI为例,使用磁珠法(MB-SELEX)获得特异性适配体MBMI-01和MBGI-02;又创建了二氧化锰法(MnO_2-SELEX)用于广谱适配体的筛选,并获得具有双靶标亲和性的适配体Mn-13。随后基于Mfol此网站d预测的二级结构模型对适配体进行初步截短;又通过改进的自发结合的分子动力学模拟获得适配体与靶标的三维互作模型,实现作用位点的从头确定和进一步优化,显著提升了适配体的亲和力和特异性。最后基于优化后适配体开发了生物传感器,初步应用于水样和血样中CTX-MI和CTX-GI的快速定量。具体结果如下:1.适配体的筛选采用MB-SELEX和MnO_2-SELEX。MB-SELEX用于特异性适配体的筛选,分别以CTX-MI和CTX-GI为靶标进行两次独立筛选。高通量测序结果显示,经过12轮正向筛选和6轮反向筛选,文库的序列多样性显著降低,高亲和力序列显示出富集优势。另外,本文验证了MnO_2纳米片作为ss DNA固定材料的可行性,基于文库固定原理设计了MnO_2-SELEX法,并以混合毒素为靶标经10轮筛选获得双靶标亲和适配体。根据序列富集程度和吉布斯自由能筛选优势适配体,利用生物膜干涉(Biolayer interferometry,BLI)法初步确定其亲和力和特异性,最终获得CTX-MI特异性适配体MBMI-01(K_D=850 n M)、CTX-GI特异性适配体MBGI-02(K_D=610 n M)和广谱适配体Mn-13(与CTX-MI和CTX-GI结合的K_D值分别为530和740 n M)。2.经post-SELEX过程进一步提升适配体的亲和特性。首先去除适配体两端的固定区域,新序列MBMI-01R、MBGI-02R和Mn-13R的亲和力未见显著变化。随后基于Mfold预测的二级结构模型,将MBGI-02R截短为25 nt的茎环结构,新适配体MBGI-01Rb的亲和力由610 n M提升至39 n M。然而,MBMI-01R和Mn-13R可形成G-四联体,Mfold输出的单平面二级结构模型与实际的双平面结构存在较大偏差,不能作为序列优化的结构依据。三维互作模型可以直观展现适配体与靶标结合的真实构象,但对于作用区域未知的Digital mediaG-四联体型适配体,现有的算法无法将其作为柔性链进行逐个核苷酸与靶标的互作模拟。因此以MBMI-01R为例,调用半经验公式进行算法优化,获得MBMI-01R与CTX-MI的三维互作模型,并确定其互作核心为11个核苷酸残基构成的口袋结构,可通过氢键网络特异地将CTX-MI分子固定在其中。随后基于此模型进行截短和突变优化,增加互作位点、减少空间位阻并简化G-四联体骨架,最终获得35 nt的新序列MBMI-01R_6,使其对CTX-MI的亲和力由850 n M提升至60.5 n M。3.分别将MBMI-01R_6和MBGI-02Rb与BLI检测技术联用,制得适配体生物传感器。经鉴定所得传感器可保存一个月并重复使用至少10获悉更多次。其中CTX-MI适配体传感器的线性检测范围是1-50μM,LOD和LOQ分别是77.5和258.2 n M;CTX-GI适配体传感器的线性检测范围是2.5-70μM,LOD和LOQ分别是128.8和429.2 n M。随后对加标的海水、自来水和血液样品进行检测,回收率稳定在92.22-109.35%,变异系数均小于7.5%,证明所得适配体传感器可用于实际样本中CTX-MI和CTX-GI的定量检测。与现有的检测方法相比,所得适配体传感器不需要复杂的样品提纯处理、可在10 min内完成样本检测、所用耗材均可重复利用,更适用于就地检测、批量筛查和快速诊断,有望用于相关地区CTXs毒性的预警和中毒的及时确诊。综上所述,本文经过适配体的筛选、表征和优化,获得CTX-MI和CTX-GI的特异性高亲和适配体,并将其初步应用于实际样品中靶标的快速定量,有望突破现有质谱手段的局限,用于现场检测和快速诊断。除此之外,所使用的适配体筛选、表征、优化及应用的程序性流程,同样适用于其他CTXs核酸适配体的获得和应用性探究。