Achr receptor

短双歧杆菌亚油酸异构酶(Bifidobacterium breve isomerase,BBI)是乳酸菌中单酶催化生成顺9,反11-共轭亚油酸单体(c9,t11-CLA)的亚油酸异构酶。作为一种具有九次跨膜结构的膜结合蛋白,BBI在原始菌中表达量极低,导致该酶的结构与功能关系研究变得困难,也限制了其进一步开发应用。本文通过比较BBI在模式微生物大肠杆菌和毕赤酵母中的表达水平差异,确定了BBI在两种表达系统中的适用范围,并在此基础上建立BBI的纯化流程,开展了酶动力学研究,同时预测和验证了该酶的活性位点,这些研究结果为该酶的进一步开发应用打下了坚实的基础。本文的主要研究结果如下:(1)膜结合型亚油酸异构酶BBI表达系统的优化与适用范围的确定。对大肠杆菌BBI的表达宿主、标签位置、诱导条件进行优化,确定最佳表达条件为:羧基端融合His标签的BBI在E.coli Rosetta菌株中进行表达,以1.0 mmol/L的IPTG诱导8 h。比较BBI在大肠杆菌和毕赤酵母系统中的蛋白表达水平,分析后确定利用毕赤酵母系统表达BBI并进行后续纯MLN8237研究购买化研究,利用大肠杆菌系统进行BBI的功能验证。(2)膜结合型亚油酸异构酶BBI纯化流程的构建。为实现九次跨膜的膜结合型蛋白BBI的高效分离和提取,首先进行膜组分分离条件的优化,确定10000 g、1 h作为膜组分富集的条件;接着通过对离子型、非离子型和两性离子型在内的10种去垢剂进行筛选,确定2%(w/v)的十二烷基-β-D-麦芽糖苷、4°C孵育2 h作为BBI的提取条件;最后联用亲和层析和凝胶分离层析,获得了分子量约为40 k Da的电泳纯BBI,比酶活为17.44μmol·min~(-1)·mg~(-1),纯化约669.54倍。(3)膜结合型亚油酸异构酶BBI酶学性质的研究。BBI纯酶的最适作用温度为37°C,最适p H为7.5～8.5,在37°C时半衰期为32.24 min,在p H 7.5～8.5范围内可以维持较高的催化活性。Ni~(2+)和Zn~(2+)可将BBI的酶活性提升至150%～160%,而Cu~(2+)、Fe~(2+)、Al~(3+)使BBI活力基本丧失。当以亚油酸、α-亚麻酸和γ-亚麻酸为底物时,BBI与γ-亚麻酸亲和度最高,其Km值为125.89 mg/L,k_(cat)/K_m值大小依次为α-亚麻酸、亚油酸和γ-亚麻酸,BBI对α-亚麻酸的催化效率最高。(4)膜结合型亚油酸异构酶BBI活性位点的预测与验证。基于蛋白结构模拟、分子对接和虚拟突变技术,分别构建了片段截短和点突变的重组菌进行验证。研究结果显示截去氨基端跨膜螺旋可能会造成BBI三维结构发生不利变化,影响其催化活性;截去羧基端跨膜螺旋可能导致BBI无法定位到膜上或者无法正确组装。活性空腔远端的跨膜螺旋结构对于BBI的活性构象,具有同样重要的作用。进一步利用分子对接模拟氨基酸突变前后的能量变化,利用大肠杆菌表达系统筛选了潜在的活性位点,通过毕赤酵母表Sickle cell hepatopathy达系统对潜在活性位点进行AMG510验证,最终确认了Y205为关键氨基酸残基,同时筛选获得了一株Y205M突变体株可使BBI相对酶活性提升至111%。

荔枝是中国重要的热带和亚热带水果,而荔枝霜疫病严重影响主产区荔枝的品质产量以及荔枝贮藏、运输。因此该研究以该病病原菌荔枝霜疫霉Peronophythora litchii为研究对象,研究其致病机制,以期发现新的致病关键基因和病害防控的分子靶标。本研究首先通过生物信息学方法,鉴定了荔枝霜疫霉MAPK家族成员PlMAPK2是Kss1/Fus3型丝裂原活化蛋白激酶,具有保守功能域STKc_MAPK。PlMAPK2在孢子囊和侵染1.5 h上调表达15倍以上,表明这阶段起着重要的调控作用。然后运用CRISPR/Cas9基因编辑技术对PlMAPK2进行敲除,成功得到PlMAPK2的两个敲除突变体:M113和M115。对PlMAPK2敲除突变体的游动孢子释放率、孢子囊数量及大小、菌丝生长、卵孢子大小及数量、细胞壁胁迫、过氧化氢胁迫和高渗胁迫等进行了测定。结果显示PlMAPK2的敲除突购买VX-661变体游动孢子释放率较野生型WT和对照组CK显著降低,但PlMAPK2的敲除不影响孢子囊数量及大小、菌丝生长和卵孢子大小及数量、细胞壁胁迫、过氧化氢胁迫和高渗胁迫,表明PlMAPK2在游动孢子的释放过程中发挥功能。为了探究游动孢释放率下降的原因,了解PlMAPK2是否参与孢子囊原生质割裂过程,利用特异性标记染料FM4-64、DAPI对PlMAPK2的敲除突变体的孢子囊细胞膜和细胞核进行染色,结果表明PlMAPK2在荔枝霜疫霉孢子囊割裂过程中发挥关键作用。为进一步分析PlMAPK2孢子囊不正常割裂的分子机制,我们分析了2个已报道的与孢子囊割裂相关的基因PlMYB1和PlMAD1与PlMAPK2之间的关系,结果表明PlMYB1和PlMAD1在PlMAPK2敲除突变体中显著下调表达。因此,PlMAPK2可能调控PlMAB1和PlMAD1进而影响孢子囊割裂过程。对PlMAPK2基因敲除突变体进行了致病力测定,结果显示PlMAPK2敲除突变体致病力较WT显著减弱,揭示了PlMAPK2对荔枝霜疫霉的致病性起重要作用。植物病原菌可分泌漆酶到胞外清除寄主植物产生的胼胝质和活性氧等,随后探究PlMAPK2的敲除是否会影响漆酶活性,结果显示intramedullary tibial nail,PlMAPK2基因敲除导致漆酶活性减弱;进一步分析了8个漆酶编码基因(Pl103272、Pl1104952、Pl106181、Pl106923、Pl106924、Pl106183、Pl111416、Pl111417)在PlMAPK2突变体中的转录水平,结果发现3个漆酶编码基因(Pl104952,Pl106183和Pl111417)显著下调,推测PlMAPK2的敲除影响了漆酶基因的转录水平进而影响漆酶活性。本研究发现了荔枝霜疫霉PlMAPK2在荔Trichostatin A体内枝无性繁殖和致病过程中发挥关键作用,为荔枝霜疫霉的病害防控提供了新的理论基础和靶标基因。

该研究寻找更多旨在利用野生型秀丽隐杆线虫N2对一款富含大豆异黄酮苷元的大豆酸奶进行生物活性评价。采用高效液相色谱法对该大豆酸奶中大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的含量进行分析表明，结果表明其苷元含量比未发酵豆乳增加了26.4倍。采用体外抗氧化实验和野生型秀丽隐杆线虫N2对大豆酸奶的抗氧化活性进行评价，发现发酵后的Tamoxifen供应商混合豆乳对DPPH自由PSMA-targeted radioimmunoconjugates基、超氧自由基、ABTS+自由基的清除率分别为98.03%、73.77%、83.37%，比发酵前显著提高（P<0.05）。大豆酸奶样液可将秀丽隐杆线虫的平均寿命和最大寿命分别延长21.57%和22.58%；饲喂大豆酸奶样液后，线虫体内超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性显著增强，体内活性氧（ROS）水平显著下降（P<0.05），线虫抗应激能力显著增加（P<0.05）。说明通过乳酸菌发酵制备高苷元含量的大豆酸奶，可有效提高产品抗氧化活性，并能延长秀丽隐杆线虫寿命。

为揭示奶牛肝脏脂肪变性影响生产性能的代谢机制，以健康奶牛为对照，比较分析了肝脏轻度脂肪变性奶牛的生理生化和转录组测序结果。结果表明：肝脏组织学观察发现，当脂肪变性时，苏木精-伊红（hematoxylineosin, H&E）染色切片中可观察到大小不等的近圆形空泡。与健康奶牛相比，发生脂肪变性奶牛的脂肪矫正乳、能量矫正乳、乳脂的产量均显著降低，乳脂含量也显著降低；其血液参数与健康奶牛相比无明显差异。肝脏转录组测序共发现241个差异表达基因（differentially expressedRapamycin NMR genes, DEGs），其中下调基因136个，上调基因10S63845作用5个；基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析表明，DEGs主要富集于脂质代谢相关的生物过程与分子功能中；京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Medical ResourcesGenomes, KEGG）通路富集分析表明，DEGs最显著富集于类固醇生物合成、胆固醇代谢、非酒精性脂肪性肝病等脂质代谢相关通路。另外，对全体基因进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）发现，基因富集于脂肪酸延长通路、过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路等影响脂质代谢的重要通路。以上结果提示肝脏脂肪变性影响了肝脏脂质代谢，进而影响奶牛全身代谢，引起了乳脂含量等生产性能的差异。

目的 调查神经外科手术部位感染情况并分析血清淀粉样蛋获悉更多白A(SBiocomputational methodAA)、肝素结合蛋白(HBP)对感染的预测Lorlatinib浓度价值。方法 对2019年1月—2022年12月丽水市中心医院2 930例神经外科手术患者进行回顾性调查,统计手术部位感染情况,分析不同感染类型的一般临床资料以及感染患者的病原菌分布情况,采用Logistic回归分析手术部位感染的独立影响因素,通过绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析术后血清SAA、HBP对手术部位感染的预测价值。结果 2 930例患者中,术后发生手术部位感染47例,发生率为1.60%,其中表浅切口感染9例,占比19.15%,器官腔隙感染38例,占比80.85%;47例切口感染患者中,33例检测到细菌,其中金黄色葡萄球菌是最常见的病原菌,占比36.54%;Logistic多因素回归分析显示,手术所在洁净手术室等级、使用植入物及血清SAA、HBP水平均为手术部位感染的相关影响因素(P<0.05);ROC曲线显示,血清SAA、HBP联合预测手术部位感染的敏感度、特异度、曲线下面积分别为83.91%、67.92%、0.860。结论 神经外科手术部位感染发生率较高,金黄色葡萄球菌为主要病原菌,手术所在洁净手术室等级、使用植入物以及血清SAA、HBP水平是感染的独立相关因素,尤其是SAA和HBP,作为联合预测标志物,对手术部位感染的预测具有重要的临床价值。

目的:分析孕烷X受体(progesterone X receptor,PXR)、多药耐药蛋白1(multidrug resistant protein 1,MDR1)、细胞色素P450 3A5(cytochrome P450 3A5,CYP3A5)和细胞色素Aβ pathologyP450 2B6(cytochrome P450 2B6,CYP2B6)在卵巢高级别浆液性癌(high grade serous ovarian cancer,HGSOC)组织中的表达水平及其在化疗耐药组与敏感组患者中的差异,探讨它们与HGSOC化疗耐药及临床病理特征的关系,寻找影响HGSOC病人化疗的敏感性指标,为HGSOC的个体化治疗提供更多的理论依据。方法:选取2019年01月至2021年12月期间青岛市市立医院妇科收治的56例HGSOC患者的卵巢肿瘤组织标本作为研究对象,根据对化疗是否敏感分为耐药组(24例)和敏感组(32例);同时选择妇科同期入院的子宫肌瘤患者的正常输卵管伞端(umbrella of normal fallopian,UNF)16例作为对照组。采用免疫组织化学法(SP二步法)、实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹分析(western blot,WB)法测定PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6在HGSOC及UNF组织标本中的表达情况。收集HGSOC及UNF组的一般信息资料,收集HGSOC患者的临床病理资料并对其进行随访。采用SPSS 20.0统计分析软件对数据进行统计学处理。组间比较采用独立样本的t检验或χ2检验,采用Spearman相关性分析PXR与MDR1、CYP3A5、CYP2B6之间的相关关系。结果:1、PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6在HGSOC患者及UNF对照组中的表达情况比较:(1)免疫组织化学检测结果:HGSOC患者PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6的阳性表达率分别为7BLZ945临床试验1.4%、75.0%、73.2%和76.8%,均显著高于UNF对照组的阳性表达率(12.5%、25.0%、18.8%和25.0%),差异均具有统计学意义(均P<0.05)。(2)实时荧光定量PCR检测结果:HGSOC患者的PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6 m RNA的相对表达量均明显高于UNF对照组(t=12.634、9.264、11.888、6.544,均P<0.05)。(3)WB检测结果:HGSOC患者的PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6蛋白表达量均高于UNF对照组(t=11.618、7.821、8.726、9.032,均P<0.01)。2、PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6在HGSOC化疗耐药组与敏感组中的表达情况比较:(1)免疫组织化学检测结果:HGSOC耐药组患者的PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6的阳性表达率分别为87.5%、91.7%、87.5%和95.8%,均明显高于HGSOC敏感组患者的阳性表达率(59.4%、62.5%、62.5%和62.5%),差异均具有统计学意义(均P<0.05)。(2)实时荧光定量PCR检测结果:HGSOC耐药组患者的PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6 m RNA的相对表达量均明显高于HGSOC敏感组患者(t=31.622、24.695、26.940、32.135,均P<0.05)。(3)WB检测结果:SB203580体内HGSOC耐药组患者的PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6蛋白表达量均高于HGSOC敏感组(t=29.506、31.430、28.642、39.127,均P<0.05)。3、在HGSOC中,PXR与CYP3A5、CYP2B6的表达呈正相关(rs=0.332,P=0.013;rs=0.308,P=0.021),而与MDR1无明显相关性(rs=-0.091,P=0.503)。4、PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6阳性表达与HGSOC患者淋巴结转移、术后复发有关(均P<0.05),PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6阳性表达患者的淋巴结转移率更高、术后复发率更高。结论:(1)PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6的异常表达可能参与了HGSOC的发生、发展过程,可用于HGSOC的辅助诊断。(2)PXR与CYP3A5、CYP2B6在HGSOC发展过程中可能存在协同调控作用。(3)PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6可能与肿瘤高侵袭性有关,可用于评价HGSOC患者的预后。(4)PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6的表达情况可用于判断HGSOC对化疗的敏感性,有助于为术后化疗提供指导意见。

目的：调查青光眼合并白内障患者生活质量现况并分析其影响因素，为临床诊疗方案提供参考。方法：选取2021年1月—2023年1月河南省人民医院就诊的medicine management102例青光眼患者作为研究对象，所有患者均伴有白内障。以视功能相关的生存质量量表（NEI-VFQ-25）评估患者生活质量，收集患者一般资料，对比不同患者NEI-VFQ-25评分，筛选差异有统计学意义的指标进入多元线Puromycin研究购买性多因素回归分析患者生活质量影响因素。结果：102例青光眼合并白内障患者NEI-VFQ-25评分为（61.42±9.58）分；多元线性回归分析显示，视力、病位、社会支持、抑郁情绪、焦虑情绪、家庭人均月收入、延Dinaciclib化学结构续护理是患者生活质量影响因素（P<0.05）。结论：青光眼合并白内障患者生活质量较差，且受视力、病位、焦虑情绪、延续护理等多因素影响，临床可据此开展针对性护理以提高患者生活质量。

目的 探究卵巢癌铁死亡关键差异基因及其潜在作用机制。方法 基于Illumina测序平台对铁死亡诱导剂大鼠肉瘤基因选择性致死化合物3(RSL3)给药后的卵巢癌OVCAR8细胞株进行转录组测序。采用https://www.selleck.cn/products/pf-07321332.htmlDESeq2算法筛选卵巢癌铁死亡差异基因，并采用基因本体(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)、基因集富集分析(GSEA)和蛋白互作网络(PPI)分析对差异基因富集的分子功能和信号通路进行综合分析。结果 转录组测序数据质控合格，平均比对率为(0.968±0.002)%。差异分析共筛选出1 834个铁死亡差异基因，其中包括805个上调基因和1 029个下调基因。GO和KEGG分析显示差异基因主要富集在细胞周期相关生物学功能以及铁死亡、内质网蛋白加工、p53信号通路、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等信号通路。GSEA分析显示诱导卵巢癌细胞铁死亡激活了单加氧酶活性、铁离子集合等分子功能，过氧Cancer microbiome化物生物合成、花生四烯代谢和铁离子响应等生物学过程以及干扰素α、β信号、下调顺铂耐药、铁摄取和转运等信号通路。PPI分析确定了5个铁死亡关键差异基因，包括细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、细胞周期蛋白A2(CCNA2)、细胞周期蛋白B1(CCNB1)、polo样激酶1(PLK1)、乳腺癌1号基因(BRCA1)。结论 基于转录组测序和此网站生物信息学分析能有效识别卵巢癌铁死亡差异基因及其信号通路，为靶向铁死亡开发新的卵巢癌治疗策略提供了潜在的药物作用靶点。

目的:胆汁淤积是胆汁淤积性肝病(CLD)的主要表现,CLD有发展为终末期肝病的风险。栀子具有清肝利胆的功效,常用于治疗肝胆湿热。研究表明,栀子提取物(栀子总环烯醚萜苷提取物)可改善胆汁淤积性肝损伤,但其潜在机制尚不清楚。因此,本研究采用α-萘基异硫氰酸酯(ANIT)诱导急、慢性胆汁淤积性肝损伤模型,研究栀子提取物(GE)改善急、慢性胆汁淤积性肝损伤的药效作用,通过胆汁酸靶向代谢组学和肝脏转录组学等,阐明GE治疗急、慢性胆汁淤积性肝损伤的作用机制,为栀子的临床应用及新药研发提供科学依据。方法:1.UPLC-MS/MS法同时定量分析生物样本中31种胆汁酸的方法学研究本研究采用UPLC-MS/MS定量分析系统,建立同时定量分析胆汁酸(BAs)肝肠循环9个部位的生物样本中31种BAs的分析方法。方法学验证包括选择性、残留、定量下限(LLoQ)、标准曲线、准确度、精密度、基质效应、稳定性和回收率等。2.栀子提取物对急性胆汁淤积性肝损伤的改善作用及机制研究SPF级雄性SD大鼠40只,随机分为5组:对照组、模型组、奥贝胆酸组(OCA)、GE低剂量组(GE-L)和GE高剂量组(GE-H),每组8只。OCA、GE-L和GE-H组的大鼠分别灌胃给予OCA(2mg·kg-1)、GE(21mg·kg-1和42mg·kg-1),每天一次,连续5天。对照组和模型组给予等体积饮用水(10mL·kg-1)。第3天给药1小时后,对照组给予葵花籽油(5mL·kg-1),其余各组灌胃ANIT(40mg·kg-1)造模。末次给药前禁食12h,收集尿液和粪便。末次给药1h后,1%戊巴比妥钠麻醉大鼠。腹主动脉取血,离心(3000rpm,15min,4℃)分离血清。摘取肝脏,收集十二指肠、空肠、回肠和盲肠内容物用于BAs检测;取部分肝脏、回肠、结肠组织用于qRT-PCR,-80℃冰箱保存备用;部分肝脏用福尔马林固定,用于病理观察。采用血清生化分析仪检测血清生化指标(ALP、GGT、TBA、TBIL和DBIL)。采用HE染色观察肝组织病理损伤情况。采用UPLC-MS/MS定量分析血清、肝脏、尿液、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和粪便中的BAs水平。采用Illumina BeadChips ArrayTM进行肝脏转录组测序(RNA-seq)分析(n=3,对照组/模型组/OCA组/GE-H),并用qRT-PCR方法对RNA-seq结果进行验证。3.栀子提取物对慢性胆汁淤积性肝损伤的改善作用及机制研究SPF级雄性SD大鼠65只,随机分为6组:对照组、模型组、奥贝胆酸组(OCA)、茵栀黄组(YZH)、GE低剂量组(GE-L)和GE高剂量组(GE-H),每组10～11只。除对照组外,其余各组大鼠每周3次灌胃ANIT(40mg·kg-1)造模。从第3w开始,OCA、YZH、GE-L和GE-H组的大鼠分别灌胃给予OCA(2mg·kg-1)、YZH(6.35mL·kg-1)、GE(21mg·kg-1 和 42mg·kg-1),对照组和模型组给予等体积饮用水(10mL·kg-1),每天给药1次,于给药后4w、6w分批取材。血清生化指标、病理检查以及BAs检测方法同上。取第二批取材时的肝组织,采用10x Genomics ChromiumTM进行单细胞转录组测序(snRNA-seq)分析(n=3,对照组/模型组/GE-H组),并用qRT-PCR方法对snRNA-seq结果进行验证。结果:1.UPLC-MS/MS法同时定量分析生物样本中31种胆汁酸的方法学研究基于UPLC-MS/MS成功建立了高通量、灵敏的BAs靶向代谢组学分析方法,可同时定量测定血清、肝脏、尿液、肠道内容物(十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠)和粪便等9类生物样本中31种BAs。所建立的方法其选择性、残留、定量下限Adezmapimod(LLoQ)、标准曲线、准确度、精密度、基质效应、稳定性和回收率等结果均符合2020版《中国药典》设定的生物样品测定要求。所建立的BAs分析方法解决了 BAs测定中性质相似及构象异构体的分离,且峰形互不干扰,分离效果较好。2.栀子提取物对急性胆汁淤积性肝损伤的改善作用及机制研究(1)栀子提取物对ANIT致急性胆汁淤积性肝损伤的药效学研究与对照组相比,模型组大鼠血清TBA、TBIL、DBIL、ALP和GGT水平显著升高(P<0.05)。与模型组相比,GE-H组血清TBA、TBIL和DBIL浓度显著降低(P<0.05),而OCA和GE-L组仅表现出降低趋势。GE-H组的ALP浓度表现出明显的降低趋势,且降幅大于OCA组。组织形态学显示,与对照组相比,模型组肝组织有明显的胆管增生(7/8大鼠评分≥3)、门管区可见炎性细胞浸润(5/8大鼠评分≥3)。与模型组相比,GE-L和GE-H组的胆管增生和炎性细胞浸润程度明显减轻,尤其是GE-H对胆管增生的改善作用更明显,GE-H组2/8大鼠肝脏形态学基本正常。OCA组的改善效果与GE-H组相似。血清生化和肝组织病理结果表明,GE可剂量依赖性明显改善ANIT诱导的急性胆汁淤积性肝损伤。(2)栀子提取物改善急性胆汁淤积性肝损伤的作用机制模型组胆汁酸肝肠循环各部位的总胆酸(TBA)、初级胆汁酸(PBA)、次级胆汁酸(SBA)、游离型胆汁酸(UnconBA)、结合型胆汁酸(ConBA)、牛磺结合型胆汁酸(TaurineBA)和甘氨结合型胆汁酸(GlycineBA)的含量和比例发生明显变化,尤其是肝脏、血清、尿液和粪便中TaurineBA及PBA的变化最明显。与对照组比较,模型组肝脏、血清和尿液中的TBA、PBA和TaurineBA水平显著升高(p<0.01),其中TaurineBA的比例分别增高55.98%→94.99%、17.13%→88.87%、8.87%→77.51%;粪便中 TBA 和 PBA 水平显著降低(p<0.01)。与模型组比较,GE-H组和OCA组肝脏中TBA、PBA和TaurineBA水平明显降低;GE-H组血清和尿液中TBA、PBA和TaurineBA显著降低;GE-H组粪便中TBA和PBA显著升高(p<0.05)。采用单元分析(p<0.05)和多元分析(VIP>1)统计的显著性来识别对照组和模型组之间的差异性胆汁酸。Tβ-MCA、TCA和GCA是大鼠肝脏中的差异性胆汁酸,血清和尿液中的差异性胆汁酸与肝脏基本相似,而粪便中的差异性胆汁酸是β-MCA和DCA。与对照组相比,模型组肝脏、血清和尿液中的TCA和Tβ-MCA水平显著升高,粪便中β-MCA和DCA显著降低(p<0.05)。与模型组相比,GE-H组血清和尿液中TCA显著降低,粪便中β-MCA和DCA显著升高(P<0.05)。肝脏RNA-seq的差异表达基因(DEGs)及KEGG通路富集分析结果显示,模型组、GE-H和OCA组的DEGs显著富集于PBA生物合成和胆汁分泌通路。与模型组相比,GE和OCA给药处理后,参与PBA生物合成和胆汁分泌的部分基因(如Cyp8b1、Cyp27a1、Fxr、Oatp1、Ntcp和Ugt1a1等)表达上调。采用qRT-PCR对RNA-seq结果进行验证,与对照组相比,模型组肝脏中Cyp8b1、Fxr、Shp、Oatp1和Ntcp mRNA表达显著下调(p<0.001);与模型组相比,GE-H组Cyp8b1、Fxr和Oatp1 mRNA的表达显著上调(p<0.05)。BAs定量、RNAseq及qRT-PCR验证结果表明,GE主要通过上调Cyp8b1 mRNA表达来抑制肝脏中PBA生物合成,从而降低肝脏BAs水平;上调Fxr和Oatp1mRNA表达,促进BAs经肝-肠-粪便途径排泄,并抑制肝脏中PBA经替代途径进入血液,降低血清BAs水平,从而减轻肝脏胆汁淤积,改善BAs肝肠循环紊乱。3.栀子提取物对慢性胆汁淤积性肝损伤的改善作用及机制研究(1)栀子提取物对ANIT致慢性胆汁淤积性肝损伤的药效学研究经每周3次给予40mg·kg-1 ANIT反复刺激,6w和8w生化和肝脏病理检查,证明慢性胆汁淤积性肝损伤模型造模成功,模型组表现为TBIL、DBIL、ALP、GGT等水平持续升高(p<0.05),肝脏病理显示有明显胆管增生、胆管及其周围炎性细胞浸润,片状纤维化。GE给药后4w、6w血清中TBIL、DBIL、ALP和GGT均较模型组未见统计学显著性差异。由于栀子苷反复较长时间给药可在体内形成灰蓝色色素类物质,可能干扰以上指标的测定,这可能是生化指标未见显著变化的原因。因此,本研究以病理的改善为直接依据。对照组大鼠肝细胞形态未见明显异常,细胞排列整齐,肝索肝窦分界明显,在门管区偶见轻微的炎性细胞浸润,未见胆管增生等病理改变。造模6w和8w,均可见肝组织中胆管增生明显,呈弥漫性,并延伸进入肝小叶中,增生的胆管周围可见明显的炎性细胞浸润,随时间延长病变加重。GE-L组给药4w后病理损伤未见明显改善,但是延长给药时间至6w后可见胆管增生程度明显减轻,病变范围减小,呈局灶性;GE-H组给药4w和6w可明显改善胆管增生,缩小病变范围。YZH组的改善效果与GE-H组相似。马松染色结果与HE染色结果基本一致。上述结果表明,GE对慢性胆汁淤积性肝损伤病理具有明显的改善作用。(2)栀子提取物改善慢性胆汁淤积性肝损伤的作用机制造模6w后,模型组大鼠肝脏和血清中ConBA、TaurineBA、PBA、TBA和UnconBA水平显著升高(p<0.05),其余类型胆汁酸有升高趋势;十二指肠中SBA显著降低(p<0.05)。给予GE、OCA、YZH治疗4w(造模6w)后,与模型组相比,肝脏和血清中的胆汁酸水平未见明显改变,但十二指肠中各类型胆汁酸水平呈升高趋势。造模8w后,模型组大鼠肝脏中PBA显著升高,肝脏和血清中ConBA、GlycineBA和TaurineBA显著升高(P<0.05)。与模型组相比,GE、OCA、YZH组肝脏和血清中各类型胆汁酸水平有降低趋势,且GE-H组降低趋势较GE-L组明显。造模8w时,对照组和模型组肝脏中的差异胆汁酸是Tβ-MCA、TCA、TCDCA和GCA,血清中的差异性胆汁酸与肝脏基本相似。与对照组相比,模型组血清中Tβ-MCA、TCA、TCDCA和GCA水平显著升高(p<0.01);同时期GE和OCA组血清中Tβ-MCA、TCA、TCDCA和GCA水平明显降低,其中GE-H组的TCDCA的水平显著降低(p<0.01)。通过肝组织单核转录组测序(snRNA-seq)分析,进一步阐释GE通过影响BAs代谢、胆管细胞增殖而改善慢性胆汁淤积性肝病的作用机制。肝脏DEGs的KEGG通路富集分析结果表明,GE-H组与药效相关的基因显著富集(padj<0.05)于PBA生物合成和胆汁分泌通路,与模型组相比,GE处理后可使参与PBA生物合成和胆汁分泌通路的多种基因(如Cyp8b1、Cyp2 7a1、Fxr、Shp、Mrp2、Bsep、Ntcp、Oatp1和Asbt等)表达上调,部分基因(如Cyp 7a1、Slc27a5和Baat等)表达下调。采用qRT-PCR对snRNA-seq的结果进行验证,与对照组相比,模型组中Cyp7a1和Mrp3 mRNA表达显著上调,Sult2a1和Oatp1 mRNA显著下调(p<0.05)。而给予GE、茵栀黄后,大鼠肝脏中Cyp 7a1和BacsmRNA的表达明显下调、Ostα mRNA显著下调(p<0.05)。综上所述,GE可能主要通过抑制BAs合成限速酶Cyp7a1 mRNA的表达来影响肝脏中PBA的合成,并调控参与BAs转运相关的多种转运体,促进BAs的排泄,降低血清和肝脏中胆汁酸水平,从而改善慢性胆汁蓄积性肝损伤大鼠的BAs代谢,减轻胆汁淤积所造成的肝脏损伤。依据seurat聚类结果进行分析,通过差异表达marker基因(differentially expressed marker genes)进行肝脏细胞定义,对照组、模型组和GE-H组的肝脏细胞都定义出8种细胞簇:肝细胞(Hepatocytes)、枯否细胞(Kuffer cells)、肝星状细胞(Hepatic stellate)、内皮细胞(Endothelials)、炎性巨噬细胞/单核细胞(Inflammatory macrophages/monocyte)、yδ T 细胞(yδ T cells)、成熟 B细胞(Mature B cells)和胆管细胞(Cholangiocytes)。与对照组相比,模型组的胆管细胞数量明显增多(对照组vs模型组:0.05%vs 14.90%),而肝细胞数量明显减少(66.90%vs 50%)。给予GE-H治疗后,胆管细胞数量明显减少(GE-H组vs模型组:9.40%vs 14.90%),而肝细胞数量轻度增加(55.50%vs 50%)。随后对胆管细胞进行进一步亚群分类,共定义出3种细胞簇:胆管样细胞(cholangiocyte-like)、肝样细胞(hepatocyte-like)和肝祖细胞。与对照组比较,模型组中肝祖细胞和肝样细胞数量明显增多;而GE-H组肝祖细胞和肝样细胞数量均明显减少。提示部分胆管细胞可能是由肝细胞分化而来的,而GE可通过抑制这一分化作用,减少胆管细胞增生。为了验证这一结论,对肝细胞和胆管细胞进行了拟时(pseudotime)分析,结果显示对照组的肝细胞和胆管细胞处于2种不同的状态,模型组的部分肝细胞出现在胆管细胞处于的状态,表明肝脏长期胆汁淤积后部分肝细胞分化为胆管细胞。GE-H组的两种细胞所处状态与模型组类似,但处于胆管细胞状态的肝细胞数量较模型组少。肝细胞转化而来的胆管细胞属于肝胆双表型细胞,既具有肝脏细胞的胆汁合成与分泌特性,又具有胆管细胞易感炎性刺激而激活增殖的特性,在慢性胆汁淤积性肝损伤病情发展中起重要作用。综上所述,GE可能通过抑制肝细胞分化为胆管细胞,抑制肝胆双表型细胞增生和异常的胆汁分泌,从而减轻胆管增生和炎症,减轻慢性肝损伤的进展。结论:1.GE对急、慢性胆汁淤积性肝损伤具有改善作用,该作用可能与减轻肝脏损伤和炎性浸润,抑制胆管和纤维组织增生,进而改善大鼠体内胆汁酸稳态有关。2.GE改善急性胆汁淤积性肝损伤的作用机制可能与上调Cyp8b1 mRNA的表达,抑制肝脏中PBA(尤其是TCA和Tβ-MCA)合成,并且上调核受体Fxr和转运体Oatp1 mRNA表达,促进肝脏中PBA经肝-肠-粪便途径排出体外,抑制肝脏中PBA经替代途径进入血液,降低肝脏和血清中BAs水平而产生抗急性胆汁淤积肝损伤的作用。3.GE可能一方面通过抑制肝细胞分化overwhelming post-splenectomy infection为胆管细胞,抑制肝胆双表型细胞增生和异常的胆汁分泌,从而减轻胆管增生和炎症,减轻慢性肝损伤的进展;另一方面通过抑制BAs合成限速酶Cyp7a1 mRNA的表达,抑制肝脏中PBA(尤其是TCDCA、GCA、Tβ-MCA和TCA)的合成,并调控参与BAs分泌相关的核受体和多种转运体的表达,抑制肝脏PBA进入血液,促进BAs经肝-肠-粪便途径排泄,降低肝脏和血清中BAs的水平而产生抗慢性胆汁淤积性肝损伤的作用。4.本研究所建立的BAs分析方法可同时定量分析BAs肝肠循环各部位胆汁酸水平,评估药物对BAs肝肠循环的影响。血清中的差异性胆汁酸TCA、Tβ-MCA和GCA,不仅可以作为诊断胆汁淤积性肝损伤的生物标志物,还可以判断药物是SBE-β-CD使用方法否产生肝保护作用。

目的通过比较房角镜辅助内路小梁切开术(gonioscopy-assisted transluminal trabeculotomy,GATT)与复合式小梁切除术(trabeculectomy,TRAB)治疗开角型青光眼(open-angle glaucoma,OAG)患者的降眼压效果及手术并发症,评估GATT治疗OAG的疗效和安全性,以期为OAG的手术治疗提供新的选择。方法回顾性研究,在2018年11月至2022年1月期间,对山东大学齐鲁医院眼科收治的60例(60眼)OAG患者进行回顾性观察和分析。观察组(GATT组)为接受GATT治疗的OAG患者,共计30例(30眼)。对照组(TRAB组)为接受TRAB治疗的OAG患者,共计30例(30眼)。两种手术均由同一位临床经验丰富的眼科医师实施。记录selleck手术用时和观察组术中小梁网切开范围,记录术前和术后第1天、1周、1个月、2个月、3个月、6个月和12个月术眼的眼压(intraocular pressure,IOP)、降眼压药物的使用情况和术后并发症,于术后12个月时复查术眼的视野和光学相干断层成像,记录视野平均缺损(mean deviation,M确认细节D)值和视网膜神经纤维层(retinal nerve fiber layer,RNFL)厚度,并进行统计学分析。结果1、眼压:两组患者的术前眼压无统计学差异(P>0.05),除术后第1天TRAB组的眼压明显高于GATT组外(P<0.01),术后其他随访时间两组患者的眼压均无统计学差异(P>0.05)。术后12个月时,两组患者的眼压均较术前明显降低(P<0.001),两组患者的降眼压幅度无统计学差异(P>0.05)。2、降眼压药物的使用情况:术后12个月时,两组患者的降眼压药物使用均较术前明显减少(P<0.001)。3、视野MD值:手术前后两组患者间的视野MD值均无统计学差异(P>0.05)。与术前相比,两组患者在术后12个月时的视野MD值均无统计学差异(P>0.05)。4、RNFL厚度:手术前后两组患者间的RNFL厚度均无统计学差异(P>0.05)。与术前相比,两组患者在术后12个月时的RNFL厚度均明显降低(P<0.01)。5、手术用时和小梁网切开范围:两组患者的手术用时无统计学差异(P>0.05)。抗青光眼手术史对GATT组的手术用时和小梁网切开范围无明显影响(P>0.05)。6、手术成功率和手术并发症:术后12个月时,两组患者的手术完全成功率和手术条件成功率均无统计学差异(P>0.05)。术后12个月时,两组患者的手术并发症发生率无统计学差异(P>0.05),但两组患者的手术并发症类型不同,GATT组主要为前房积血,TRAB组主要为滤过泡相关并发症。extramedullary disease结论GATT和TRAB均能有效降低OAG患者的眼压,减少降眼压药物的使用,延缓视野损害,末次随访时两种手术的手术成功率相似。与TRAB相比,GATT更微创,不破坏结膜,无需维护滤过泡,因此是治疗OAG的一种安全有效的新选择。